抗体/蛋白标记常用荧光染料选择指南

近年来，生物大分子标记技术受到很大重视并取得了迅速进展，此技术广泛应用于细胞内外物质的检测、核酸杂交测序以及疾病诊断等诸多方面。抗体/蛋白的标记原理是标记试剂与抗体/蛋白所带的巯基、氨基及羧基等基团发生置换或缩合反应连接在一起。抗体标记技术被广泛用于医学病理学、免疫组织化学、分子生物学等领域。本期小爱主要介绍3种常见的抗体标记技术：荧光素（FITC、PE、APC等）标记法、酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）标记法和生物素（Biotin）标记法。

抗体/蛋白的异硫氰酸荧光素（FITC）标记法

异硫氰酸荧光素 ( Flourescein isothiocyanate，FITC) 是在荧光素的结构上引入异硫氰基( -N = C = S) 得到的，在碱性环境下，抗体的赖氨酸R氨基与FITC的硫碳胺键共价结合，形成牢固的抗体—FITC复合物（图1），从而实现对目标分子的荧光标记。

图1 FITC标记抗体原理

荧光试剂的种类不同，标记方法各有差别，但所要求的条件和步骤大致相同。影响标记的因素有温度、MR 值及反应液中荧光试剂和免疫球蛋白的比例[1]。常用标记抗体的方法有搅拌法和透析法。方珍等[2]使用透析法对多克隆抗体进行标记。标记方法如下：

（1）取1 mg 抗体蛋白溶液，用pH9.0的碳酸盐缓冲液对抗体溶液进行透析，使蛋白处于碱性环境。

（2）确定最佳反应比值：按照FITC与蛋白含量比值分别为1:20、1: 10、3: 20 计算 FITC 用量，逐滴加 入溶于DMSO的 FITC，室温避光反应 4 h进行 FITC 标记。

（3）确定最佳标记抗体反应条件：确定FITC最佳用量后，按照反应条件为4℃、2 h；20℃、4 h；37℃、 30 min进行FITC标记。

（4）反应后液体用超滤离心管6 000 r/min 离心20 min，反复多次，收集每次离出液，测定荧光值 (F485/535)，直至离出液无荧光值。测定标记后F485/535值，结合显著性差异分析实际情况，得到最佳FITC与抗体含量比值和反应条件。

抗体/蛋白的辣根过氧化物酶（HRP）标记

HRP标记抗体的原理其表面的糖分子被氧化成醛基，与抗体的氨基共价结合，形成HRP-抗体复合物。被HRP标记的抗体在特定酶与底物下，颜色发生变化，通过对其颜色的深浅进行抗原的定性、定量分析，被广泛用于WB、ELISA、免疫组化等分析方法中。

制备辣根过氧化物酶( HRP) -抗体结合物的方法主要有戊二醛两步法和过碘酸钠法[3]。徐晶晶等[4]制备了兔源的M13KE多克隆抗体，将多克隆抗体经饱和硫酸铵法和Protein G Resin层析柱纯化后运用过碘酸钠法对其进行辣根过氧化物酶标记。标记方法如下：

（1）取4mg HRP溶于1 mL去离子水中。

（2）加入400 μL新制备的0.1 mol /L过碘酸钠室温振荡20 min;

（3）将反应物于醋酸钠缓冲液(0.001 mol /L，pH 4.4)中透析过夜；

（4）加入6 mg IgG，用0.2 mol /L碳酸钠缓冲液( pH 9.5)调节溶液pH至9. 0~9.5，立即加入 200 μL新制备的5 mg /mL NaBH4 ，于4℃作用2 h。

（5）标记物纯化：向制备好的酶结合物中缓慢滴加等体积的饱和硫酸铵，边加边搅拌，4℃沉淀30 min；5000 r/min 离心15 min，沉淀用适量的PBS溶解并加入等体积的甘油，-20℃保存，备用。

抗体/蛋白的生物素（Biotin-NHS）标记

生物素（D-Biotin），是一个分子量只有244.31Da的小分子，经活化后（Biotin-NHS）可与蛋白/抗体等生物大分子的氨基结合，不仅可以很好地保持大分子的生物活性，而且与亲和素结合使用时具有多级放大作用，使其广泛应用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究。

王雁云等[5]研究表明生物素标记人免疫球蛋白IgG 重链应有适当的比例，使被标记的生物素尽可能的多， 同时又避免过多的生物素造成空间位阻影响。该研究将生物素与人免疫球蛋白IgG 重链以各种不同的比例进行反应，然后与连接有抗人免疫球蛋白 IgG 重链抗体的微球颗粒反应，来评估生物素与待标记的人免疫球蛋白IgG重链反应的效价。标记方法如下：

（1） 取4 mg 纯化的人免疫球蛋白 IgG 重链溶解于1 mL NaHCO3 (0.1 mol/L) 中；

（2）取5 mg生物素溶解于0.5 mL DMSO中，得到10 mg/mL 的生物素溶液；

（3）在已溶解有人免疫球蛋白 IgG 重链的溶液中，缓慢加入 100μL 已经制备好的生物素 DMSO 溶液， 室温下让人免疫球蛋白IgG重链与生物素反应1h，然后让反应物过Sephadex G柱终止反应。

荧光素标记的抗体可以用来做流式细胞术FACS、IF、活体成像等标记示踪类实验；酶类标记的抗体可以直接和检测底物反应，用于ELISA、WB、IHC等实验；生物素标记的抗体可以再同酶联亲和素或酶联Anti-Biotin 抗体反应，用于抗体的纯化、测定微量抗原/抗体等。AG8亚国服务（上海）生物科技有限公司可以提供多种抗体产品以及抗体标记染料，同时可以提供蛋白/抗体标记服务，体系成熟，目前常规染料标记周期1-2周。

参考文献：

[1]陈中举,张燕玲,黄金瑛.荧光标记生物大分子及其应用[J].国外医学.生物医学工程分册, 2004, 27(6): 348-352.

[2]方珍,鞠文,秦亚楠等.大肠杆菌O157:H7异硫氰酸荧光素标记抗体的制备及评价[J].吉林大学学报(医学版), 2013, 39(1).

[3]孙凌霜,齐岩,王彬,等.鸭卵黄免疫球蛋白的提纯及兔抗鸭IgY(H+L) HRP标记抗体的制备[J].中国兽医杂志, 2007(1):10-12.

[4]徐晶晶,李迪,曹永生,等.辣根过氧化物酶标记兔抗丝状噬菌体衣壳蛋白抗体的制备与初步应用[J].黑龙江畜牧兽医, 2013(3):3.

[5]王雁云,张阳德.生物素标记人免疫球蛋白IgG重链的效果评估[J].中国现代医学杂志, 2012, 22(12):3.

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