干货 | iPS诱导脑类器官培养攻略

脑类器官概述：

11月末，小爱曾为大家讲述了3D类器官培养，相信大家对“类器官"及“3D培养"已不陌生。现阶段，类器官的培养有多种不同的方法，而不同类器官的培养亦存在一定的差异，包括：视网膜、肠、甲状腺、肝、垂体、大脑...等。

以人脑为例，因其具有高度复杂性，现如今，很多脑部疾病的研究很难在生物模型中开展，故体外模拟技术成为现在类器官培养领域的一项前沿技术。通常，研究人员可在体外环境中对大脑组织进行培育，模拟大脑发育过程，进而能够观察到人脑变化，为更深层次的脑部研究开拓思路。

接下来，小爱将为大家送上一份冬日秘籍：Nature protocol 技术干货，为大家重点解析人脑类器官的培养过程。

ips诱导脑类器官流程：

图1 大脑类器官培养流程

1、培育EB ● 1-2h

1）在六孔板的一孔中培育hESC或iPSC克隆，至汇合度为70-80％。一般而言，六孔板的一个孔可以产出大约整个96孔板所需的EB。

流程A，通过feeder依赖的PSCs培育EB；流程B，通过feeder非依赖的hESC培育EB。关键步骤：干细胞集落的形态对于脑组织形成的成功至关重要。菌落应无分化迹象，并应显示多能性的最佳特征（图2）。

feeder依赖的PSCs培育EB

图2 人PSCs培育的大脑类器官发育进程

◆ 洗涤细胞，去除hESC培养基，加1mL不含钙和镁的D-PBS。后去除D-PBS，向6孔板的每个孔中加入1mL分散酶溶液，然后将细胞放回培养箱中孵育20-30min；
◆ 去除分散酶溶液，加入1mL低bFGF的hESC培养基。轻轻敲击培养皿，以去除培养皿上的克隆而不移除MEF和已分化细胞。将含有完整克隆的培养基转移至15mL锥形管，静置约1min使得克隆沉降到试管底部；

◆ 轻轻吸出含有单细胞和MEF的上清液，注意不要干扰贴壁的细胞克隆。另添加1mL低bFGF的hESC培养基，再次使克隆沉降，后去除上清液；
◆ 将克隆重悬于1mL的胰蛋白酶消化液（0.25%，含酚红）中，并在37°C下孵育2min。加入1mL的胰蛋白酶抑制剂，并使用1mL移液器吹打混合溶液，直到溶液中出现单细胞浑浊为止。取两次5uL的细胞溶液进行计数，然后加入8mL低bFGF的hESC培养基；
◆ 在室温下以270×g离心细胞5min，同时加入等体积的台盼蓝标记死细胞。使用血细胞计数器或自动细胞计数器对细胞进行计数。使用两次计数的平均值；
◆ 首先将细胞重悬于含有ROCK抑制剂（1:100，终浓度50uM）的1mL低bFGF的hESC培养基中，多次吹打以确保混匀单细胞悬液。然后添加额外适量的带有ROCK抑制剂的低bFGF的hESC培养基，以每150uL悬液获得9000个活细胞；
◆ 低贴壁型的96孔板，每个孔中加入150uL悬液，后将其放回培养箱中。

feeder非依赖的hESCs培育EB

◆ 用1mL不含钙和镁的D-PBS洗涤细胞，并在六孔板的每个孔添加600uL不含钙和镁的0.5mM EDTA溶液，后将细胞放回培养箱中孵育4min；
◆ 轻轻吸出EDTA溶液而不干扰细胞克隆，后加入1mL的Accutase酶。将细胞放回培养箱中孵育4min；
◆ 采用1mL的mTeSR1培养基吹打细胞克隆，使其与培养皿分离。取其中2mL转移到15mL锥形管中，并使用1mL移液器吹打混合溶液，直到溶液中出现单细胞浑浊为止。取两次5uL的细胞溶液进行计数，后添加3mL mTeSR1培养基并混合均匀；
◆ 在室温下以270×g离心细胞5min，同时加入等体积的台盼蓝标记死细胞。使用血细胞计数器或自动细胞计数器对细胞进行计数。使用两次计数的平均值；
◆ 首先用1mL含ROCK抑制剂的低bFGF的hESC培养基（1:100，终浓度50uM）重悬细胞，多次吹打以确保混匀单细胞悬液。然后添加额外适量的带有ROCK抑制剂的低bFGF的hESC培养基，以每150uL悬液获得9000个活细胞；
◆ 低贴壁型的96孔板，每个孔中加入150uL悬液，后将其放回培养箱中。

2、培育EBs，启动细胞层分化 ● 5-7d

图3 不同培养阶段类器官形态

2）培育24h后在组织培养显微镜下观察细胞板，可在镜下观测到边界清晰的小规模EB。继续在组织培养箱中于37°C、5％CO2条件下培养EB；
3）每隔一天轻轻吸去大约一半体积的培养基，注意不能干扰底部的EB，添加150uL新鲜培养基（最终体积>150uL即可，具体的量并不重要）。加入ROCK抑制剂（1:100）和低bFGF培养基（4ng.mL-1），直到EB开始变亮或直径大于350-400um。可以使用配有照相机和测量软件的倒置显微镜进行尺寸测量。一般而言，在前4天添加ROCK抑制剂和低bFGF培养基。

4）当EB的直径达到350-600um，按照步骤3中所述更换培养基，但不添加ROCK抑制剂和bFGF。

3、诱导原始神经上皮细胞 ● 4-5d

5）当EB的直径达到500-600um，并且开始变亮、产生平滑的边缘时（通常是第6天，可见图2b和3），将每个EB用200uL移液枪头切面切下，移至低附贴壁型的24孔板中，每孔提前加入500uL神经细胞诱导培养基（图1），注意不要破坏EB。关键步骤：用无菌剪刀裁剪200uL移液器枪头，以获得直径1–1.5mm的开口。确保开口不要太小（会破坏EB），但也不要太大（将很难将EB吸到移液器吸头中）。请勿尝试使用刮刀或其他工具将EB从培养板中移出（会破坏EB）。
6）将EB转移至24孔板48h后，再添加500uL神经细胞诱导培养基。
7）继续培育2天后，在组织培养显微镜上观察EB。此时EB周围应该更亮，表明出现神经外胚层分化。一旦这些区域开始显示与神经上皮分化所一致的假分层上皮放射状的形态（图2c）（应在神经诱导培养基中培养4-5d后发生），继续进行步骤8，将细胞聚集体转移至基质胶液滴（图1） ）。重要步骤：健康的细胞聚集体应该具有光滑的边缘。神经上皮在外表面发育，并且在光学上是半透明的（图2c和3c，d）。关键步骤：当神经上皮出现时，请务必及时进行步骤8，将组织转移至基质胶。不要过早转移组织，否则会影响后续脑组织培养的形态。

4、将神经上皮组织转移到基质胶液滴中 ● 1-2h

8）将基质胶放于4℃冰箱过夜融化。
9）制作用于制备基质胶液滴的带凹痕封口膜。裁剪一块正方形的封口膜，放置在200uL枪头盒凹痕处，戴手套以摁压封口膜，使其形成一个个小的凹槽。
警告：因为不能对封口膜进行高压灭菌，因此在准备之前，请确保在清洁的环境中使用封口膜，并用70％（体积/体积）的乙醇对手套和封口膜进行灭菌处理。在此步骤时，培养基中还应包含抗生素以防止污染。
10）制作一个包含4×4凹槽的封口膜（总共16个凹槽），并用无菌剪刀将封口膜修剪成一个小正方形。将正方形封口膜放入60mm的组织培养皿中。关键步骤：4×4的封口膜大小适合于60mm的组织培养皿。因此，每个60mm培养皿中总包含16个基质胶液滴。
11）使用剪切好的200uL移液枪头，将神经上皮组织逐个转移到封口膜的每个凹槽中。关键步骤：同第5关键步骤。
12）用完整的200uL移液枪头顶部小心吸出液体，以去除每个组织中多余的培养基。
13）每个组织滴加约30uL的基质胶液滴，充盈整个凹槽，浸润组织。关键步骤：添加基质胶需迅速，避免组织变干。
14）使用10uL移液枪头将每个组织移置于基质胶液滴的中心（图2d）。关键步骤：添加液滴后必须立即进行此步骤，基质胶在室温条件下便会开始凝固。
15）将装有基质胶液滴封口膜的60mm培养皿，放回37°C培养箱，孵育20-30min以使基质胶聚合。
16）在60mm培养皿中加入5mL不含维生素A的脑类器官分化培养基。
17）使用无菌镊子将封口膜翻转过来，基质胶滴浸润在培养基中，再搅动培养基使得所有基质胶滴都从封口膜上脱离下来。继续在二氧化碳培养箱中培养组织液滴。

5、神经上皮芽的固定培养 ● 4d

18）培育24h后在显微镜下观察基质胶包埋的组织。组织应在1-3d内开始形成更多向外扩张的神经上皮芽，其中含有充满液体的空腔（图2e和3f）。
19）继续孵育组织24h，然后用不含维生素A的脑类器官分化培养基培养含有神经上皮组织的基质胶滴，在不搅拌的情况下孵育48h。关键步骤：倾斜培养皿，使液滴下沉，并小心吸出培养基，吸取尽可能多的培养基而不干扰基质胶滴，每次采用5mL新鲜培养基替换。

6、脑组织的生长 ● 1 year

20）静态培养4d后，使用剪切开的1mL移液器吸头（开口约3mm）将培养的类器官转移至125mL的可旋转器官培养瓶中（图1），在75-100mL含有维生素A的脑类器官分化培养基中进行培养。器官培养瓶可以放在培养箱中配套的磁力搅拌板上（图2f），也可以放在培养箱中配套的摇床上（振动速度为85rpm）。只需将每个60mm培养皿中的培养基替换为含有维生素A的脑类器官分化培养基，然后将培养皿放入培养箱中培养即可。关键步骤：不要转移过多的类器官（小于32个），过多的数量会导致类器官融合；确保使用验证应用于组织培养的培养箱低速搅拌板。
21）如步骤9所述，全量更换培养基，摇床培养时每3-4d更换，旋转培养瓶每周更换，并实时监测类器官的形态。

Lancaster M A,Knoblich J A.Generation of Cerebral Organoids from Human Pluripotent Stem Cells[J].Nature Protocols, 2014, 9(10):2329-2340.

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