类器官传代技巧——具体情况具体分析

概述：

类器官传代是一个痛点，经常出现传代后类器官丢失，类器官不长也不死，类器官凋亡。究其原因，主要是两大类，一类是类器官消化过度，一类是基质胶残留太多，和类器官难以分离，导致丢失严重。今天给大家分享类器官在传代过程中需要注意关键事项！

实验步骤：

不同类器官的培养难易程度不同，所以传代时要根据类器官培养状态具体情况具体分析，大致分为两种情况，第一种情况是类器官数量不足或体积较小时，不建议消化，我们可以来看一组类器官图片。

图1 类器官数量不足或体积较小图

一、类器官数量不足或体积较小时：

1、类器官收集及洗涤

1）移液器吸去培养基，每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液(abs9730)，轻柔吹散基质胶，收集在15mL离心管中（24孔板，每5孔为一组）；

2）进行吹打，将类器官吹成细胞团（可取样置于显微镜下观察是否吹打成细胞团）；

3）加类器官传代培养缓冲液(abs9730)定容至14mL（缓冲液越多，基质胶被稀释的越充分，越容易去除），4℃静置40min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化，如果冰箱冷冻效果强，冷冻3min），300g，4℃， 离心5min弃上清，进行第三步。注：如基质胶去除不理想，此步骤可再重复1-2次。

图2 囊泡型类器官吹打传代后图片

图3 致密型类器官吹打传代后图片

2、类器官铺板

对于类器官较少的情况，需要3-5孔富集到1孔，例如24孔板收集6孔，传代2孔，需要的基质胶量25*2=50uL，每孔25μL基质胶铺细胞团混悬物在24孔细胞培养板中，放置培养箱中40-60min，添加500μL-750uL类器官培养基。

第二种情况是类器官数量较多或体积较大时，建议消化，我们可以来看一组类器官图片。

图4 类器官数量较多或体积较大图片

二、类器官数量较多或体积较大时：

1、类器官收集及洗涤

1）移液器吸去培养基，每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液(abs9730)，轻柔吹散基质胶，收集在15mL离心管中（24孔板，每5孔为一组）（如图所示）。

2）加类器官传代培养缓冲液定容至14mL（缓冲液越多，基质胶被稀释的越充分，越容易去除），4℃静置40min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化，如果冰箱冷冻效果强，冷冻3min），300g，4℃，离心5min弃上清。

图

2、类器官消化

1）添加适量类器官传代消化液(abs9520)（是类器官悬液的1-2倍）超净台内消化2-3min（中间可以吹打1-2次）（如图7） ；

2）添加适量类器官传代培养缓冲液（缓冲液G：传代消化液D=5:1）终止消化，300g 4℃离心5min弃去上清；注：此步骤如果残留胶过多（大于50uL），可重复类器官收集及洗涤的第2步1-2遍（如图8、9）；

3）添加1mL类器官传代培养缓冲液重悬移入5mL（如图10）离心管，300g，4℃离心5min，弃上清。

三、类器官铺板

类器官通常按1:2传代，例如24孔板收集5孔，传代10孔，需要的基质胶量25*10=250uL，每孔25μL（如图11）基质胶铺细胞团混悬物在24孔细胞培养板中，放置培养箱中40-60min，添加500μL-750uL（如图12）类器官培养基。

消化传代后的类器官如下图所示

图 ICC经消化传代后的铺板图

四、类器官传代后增殖现象

常见问题：

1、收集的基质胶类器官离心后正常分成几层？

答：正常离心后会分成3层（如下图）：缓冲液、基质胶、类器官沉淀，留类器官沉淀即可。

2、收集的基质胶与类器官离心后不分层是什么原因？

答：因素很多，例如类器官数量量少，体积小，降温时间不够，基质胶粘稠等因素，离心后往往两层（如下图）。如果反复清洗离心，基质胶和类器官仍未分离，可保留基质胶类器官混悬物下2/3传代。（上1/3基本是原代细胞杂质或死细胞）

3、如何有效地分离基质和类器官？可从以下几点着手：

1、加尽可能多的缓冲液（例如15mL离心管，缓冲液加到14mL），稀释基质胶类器官混合物，能促进分离；

2、将基质胶类器官混合物放于-20℃，5min（注意：如果冰箱冷冻效果强，冷冻3min），加速基质胶液化，能促进分离；

3、离心机的选择非常重要，水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离；

4、离心机的温度最好是4℃（可避免基质胶固化），离心转速可适当提高（最高不要超过500g），离心时间可适当加长（最常不超过10min）。

今天讲解就到这了，大家如有类器官问题，欢迎公众号后台“AG8亚国服务生物"留言哦！

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