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类器官传代技巧——具体情况具体分析

更新时间:2024-01-22      点击次数:491

概述:

 

类器官传代是一个痛点,经常出现传代后类器官丢失,类器官不长也不死,类器官凋亡。究其原因,主要是两大类,一类是类器官消化过度,一类是基质胶残留太多,和类器官难以分离,导致丢失严重。今天给大家分享类器官在传代过程中需要注意关键事项!

 

实验步骤:

 

不同类器官的培养难易程度不同,所以传代时要根据类器官培养状态具体情况具体分析,大致分为两种情况,第一种情况是类器官数量不足或体积较小时,不建议消化,我们可以来看一组类器官图片。


图1 类器官数量不足或体积较小图

 

一、类器官数量不足或体积较小时:

 

1、类器官收集及洗涤

 

1)移液器吸去培养基,每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液(abs9730),轻柔吹散基质胶,收集在15mL离心管中(24孔板,每5孔为一组);

2)进行吹打,将类器官吹成细胞团(可取样置于显微镜下观察是否吹打成细胞团)

3)加类器官传代培养缓冲液(abs9730)定容至14mL(缓冲液越多,基质胶被稀释的越充分,越容易去除),4℃静置40min或-20℃放置5min(目的是使基质胶软化,如果冰箱冷冻效果强,冷冻3min),300g,4℃, 离心5min弃上清,进行第三步。注:如基质胶去除不理想,此步骤可再重复1-2次。

 


图2 囊泡型类器官吹打传代后图片


图3 致密型类器官吹打传代后图片

 

2、类器官铺板

 

对于类器官较少的情况,需要3-5孔富集到1孔,例如24孔板收集6孔,传代2孔,需要的基质胶量25*2=50uL,每孔25μL基质胶铺细胞团混悬物在24孔细胞培养板中,放置培养箱中40-60min添加500μL-750uL类器官培养基。


第二种情况是类器官数量较多或体积较大时建议消化,我们可以来看一组类器官图片。


图4 类器官数量较多或体积较大图片

 

二、类器官数量较多或体积较大时:

 

1、类器官收集及洗涤

 

1)移液器吸去培养基,每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液(abs9730),轻柔吹基质胶,收集在15mL离心管中(24孔板,每5孔为一组)(如图所示)

2)加类器官传代培养缓冲液定容至14mL(缓冲液越多,基质胶被稀释的越充分,越容易去除),4℃静置40min或-20℃放置5min(目的是使基质胶软化,如果冰箱冷冻效果强,冷冻3min),300g,4℃,离心5min弃上清。

 

 

2、类器官消化


1)添加适量类器官传代消化液(abs9520)(是类器官悬液的1-2倍)超净台内消化2-3min(中间可以吹打1-2次)(如图7) ;

2)添加适量类器官传代培养缓冲液(缓冲液G:传代消化液D=5:1)终止消化,300g 4℃离心5min弃去上清;注:此步骤如果残留胶过多(大于50uL),可重复类器官收集及洗涤的第2步1-2遍(如图8、9);

3)添加1mL类器官传代培养缓冲液重悬移入5mL(如图10)离心管,300g,4℃离心5min,弃上清。


 

三、类器官铺板

 

类器官通常按1:2传代,例如24孔板收集5孔,传代10孔,需要的基质胶量25*10=250uL,每孔25μL(如图11)基质胶铺细胞团混悬物在24孔细胞培养板中,放置培养箱中40-60min,添加500μL-750uL(如图12)类器官培养基。


 

消化传代后的类器官如下图所示


图 ICC经消化传代后的铺板图

 

四、类器官传代后增殖现象


 

常见问题:

 

1、收集的基质胶类器官离心后正常分成几层?

 

答:正常离心后会分成3层(如下图):缓冲液、基质胶、类器官沉淀,留类器官沉淀即可。


 

2、收集的基质胶与类器官离心后不分层是什么原因?

 

答:因素很多,例如类器官数量量少,体积小,降温时间不够,基质胶粘稠等因素,离心后往往两层(如下图)。如果反复清洗离心,基质胶和类器官仍未分离,可保留基质胶类器官混悬物下2/3传代。(上1/3基本是原代细胞杂质或死细胞)


 

3、如何有效地分离基质和类器官?可从以下几点着手:

 

1尽可能多的缓冲液(例如15mL离心管,缓冲液加到14mL),稀释基质胶类器官混合物,能促进分离;

2将基质胶类器官混合物放于-20℃,5min(注意:如果冰箱冷冻效果强,冷冻3min,加速基质胶液化,能促进分离;

3离心机的选择非常重要,水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离;

4离心机的温度最好是4℃(可避免基质胶固化),离心转速可适当提高(最高不要超过500g),离心时间可适当加长(最常不超过10min)。

 

今天讲解就到这了,大家如有类器官问题,欢迎公众号后台“AG8亚国服务生物"留言哦!

 

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