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免疫 (共) 沉淀 (IP/CoIP) 磁珠法VS琼脂糖珠法

更新时间:2024-01-23      点击次数:635

免疫 (共) 沉淀 (IP/CoIP)

 

是基于抗体和蛋白的特异性亲和作用,通过捕获与蛋白或抗原特异性结合的抗体,进而从复杂的样品中捕获及富集目标蛋白,同时可以测定与之相互作用的蛋白或其它生物大分子的一种技术。

 

琼脂糖珠VS磁珠

 

琼脂糖珠作为免疫沉淀实验中的固相支持物已经历经多年,随着实验技术的发展,磁珠开始大幅取代琼脂糖珠,成为免疫沉淀纯化方法的首先选择,许多刚接触的研究者都要面临方法选择的问题,磁珠法VS琼脂糖珠法,区别在哪里?分别有什么优缺点?


图1 琼脂糖珠结构


图2 磁珠

 

区别:

 

1、抗体结合量:琼脂糖珠(直径50-150μm)明显大于磁珠(直径1-4μm),所以单个琼脂糖珠结合抗体的量大于磁珠,但是磁珠每体积的磁珠比琼脂糖珠的量多;
2、结合能力:琼脂糖珠是多孔的海绵状结果,与抗体的结合能力优于磁珠;
3、非特异性结合:琼脂糖珠的非特异性结合比磁珠多,样品中的非目的蛋白或者抗体的任何部位都可能与之结合,所以在琼脂糖珠法中,样品的预处理非常重要;
4、抗体的损耗:琼脂糖珠大于磁珠,由于琼脂糖珠的多孔结构,抗体很容易被困其中,并且,离心洗涤的过程中很容易流失;
5、实验时间:磁珠法可室温短时间孵育(仅限Absin abs9649和abs955的比较);
6、特殊设备:磁珠法需要自备磁力架。

 

abs9649(磁珠法)和abs955(琼脂糖珠法)常见问题:


图 abs9649免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒(磁珠法)


图 abs955免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒

 

以下问题仅针对AG8亚国服务现有两款试剂盒abs9649和abs955

 

一、样品处理


1、两个试剂盒中lysis buffer都要添加PMSF吗,怎么使用?

 

两个试剂盒中的PMSF都要额外准备,推荐abs9146,根据使用量,取每1mL lysis buffer加入10ul PMSF(100mM,溶解174mg的abs9146于足量的异丙醇中,定容到10mL,分装成小份贮存于-20℃。)使PMSF的最终浓度为1mM,混匀备用 (PMSF现用现加)。磁珠法缓冲液请按说明书配置后使用,buffer稀释均可用超纯水。

 

2、abs9649如果没有超声破碎仪的话,能不能用酶解的办法破碎细胞?

 

酶解和超声都可以,酶按照实验室正常使用浓度配制即可。

 

3、蛋白的量如何估算?

 

可以使用BCA蛋白定量试剂盒(abs9232)。

 

4、如果我的细胞裂解物里面蛋白含量高于试剂盒要求的总蛋白含量,我应该用什么试剂进行稀释呢?

 

常规用PBS稀释即可。

 

二、如何减轻琼脂糖珠非特异性吸附?

 

可以通过多次洗涤,和样品预处理(适当延长Protein A和Protein G的孵育时间)来降低背景,但应注意,选择此步骤后,试剂盒中protein A和protein G对应实验样本数减半。

 

三、结合过程中,4℃混合过夜孵育可用什么仪器?

 

可以用混合仪abs72030或abs72019。


图 abs72019旋转混合仪(XHE-100)

四、abs955beads出现吸不出来的情况,怎么处理?

 

吸之前需注意枪头要剪一下再吸,如若beads吸不上来,可加入等体积的20%乙醇混匀后再吸。

 

五、如果我后续是想要跑native胶,不做变性电泳,如何选择样品缓冲液?

 

用不含有SDS的WB上样缓冲液,但不经过变性,蛋白能否解离下来,我们无法确定,不能保证您后续的实验效果。

 

六、磁珠法两种洗脱方案的区别?

 

两种洗脱方案均包含捕获抗体及目的抗原,低pH 洗脱样本中抗体为完整结构,变性洗脱样本中抗体解离为重链、轻链,请根据后续实验需求选择洗脱方案。

 

*文中图片来源于网络,仅供学习参考用

 

IP&WB全套试剂清单推荐:


货号

品名

规格

货期

abs955

免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒

50T

现货

abs9649

免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒(磁珠法)

50T

现货

abs9146

PMSF

100g

现货

abs9116

免疫印迹及免疫沉淀用(WB/IP)裂解液

100mL

现货

abs9239

免疫印迹及免疫沉淀用裂解液(不含蛋白酶/磷酸酶抑制剂)

100mL

现货

abs20035

Rabbit IgG Antibody

10mg

现货

abs20038

Mouse IgG Antibody

1mg

现货

abs9232

BCA蛋白定量试剂盒

500T

现货

abs924

预染蛋白marker, 10-180kDa

250uL

现货

abs950

电转液(10×)

1L

现货

abs954

WB专用一抗二抗稀释液

100mL

现货

abs961

PBS缓冲液(10×)

500mL

现货

abs952

TBST(10×)

1L

现货

abs9157

牛血清白蛋白

100g

现货

abs920

ECL化学发光检测试剂盒

250mL×2

现货




 

 

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WB相关:ECL发光液、预染marker、预制胶;IHC相关:二抗试剂盒、组化笔;IP/CoIP试剂盒;激动剂/抑制剂;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡试剂盒;呼吸爆发试剂盒;ELISA试剂盒;重组蛋白;抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体;定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...

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