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3D肿瘤球&类器官药敏活性检测攻略

更新时间:2024-02-05      点击次数:553

概述


近年来使用3D肿瘤球&肿瘤类器官模型在大型化合物库中的高通量药物筛选、检测单药或多药浓度等方面,展现出能够帮助研究者快速筛选出药物敏感性强、反应性好、效果优的癌症适应症药物的能力。在2D细胞药敏活性检测中,CCK8法应用广泛,然而在3D肿瘤球&肿瘤药物敏感活性中,ATP荧光法比CCK8法检测更准确,今天小爱带大家了解检测攻略。

 

ATP生物发光技术原理

 

本试剂盒采用生物发光(bioluminescent)法,利用Firefly luciferase(萤火虫荧光素酶)催化底物—荧光素的转化,高效利用ATP的能量,发射出光子。发光信号与存在的ATP量呈正比,而ATP与存在于类器官中的细胞数目直接呈正比,有效检测3D肿瘤球&类器官活性。


 

本试剂盒为多孔板而设计,是进行自动化高通量筛选(HTS) ,3D肿瘤球&类器官增殖和毒性分析的理想选择。均质检测步骤就是将单一试剂直接加入含有类器官培养基的孔板中,无需去除基质胶

 

均质检测的"加样-混合-检测" 的操作方案使得3D肿瘤球&类器官裂解和产生的发光信号与存在的ATP量成正比,而ATP量直接与类器官中的细胞数量成正比。特殊的均质检测方案避免了那些需要多个步骤的ATP检测方法可能会引入的误差。

 

产品组成

 


组分

10mL

100mL

保存方法

Organoid ATP 染料

1支

10支

2-8℃,避光

Organoid ATP 荧光染料 buffer

10mL

10×10mL

2-8℃,避光




注意:产品建议现配现用

 

产品特点

 

1)简化了类器官活性检测步骤:均质的"加样-混合-检测"方案减少了其它同类检测所需的操作步骤;

2)类器官用量更少:可准确地检测到低于常用的比色法和荧光法的检测低限的细胞数。 减少了每个检测反应所需的细胞数;

3)迅速获得结果:加入试剂后10min就能获得数据;

4)可自行选择检测方案:可用于多种类型的多孔板操作。可用发光检测仪或CCD成像设备记录数据;

5)可连续处理培养板:发光信号稳定,样品可进行批量处理。

 

使用方法

 

1、类器官的准备:

 

使用适合进行化学发光检测的96孔板(底和盖子透明,孔壁不透,推荐货号:abs7242),每孔接种5uL-10uL类器官基质胶混悬物,放培养箱半小时以上,待凝固后加入100uL类器官培养基(如使用384孔板,每孔接种2.5μL-4μL类器官基质胶混悬物,具体用量视不同类型的384孔板而定),并确保检测时每孔的细胞数量在5万个以内(如使用384孔板宜控制在1万个以内),同时设置不含类器官的基质胶培养液孔作为阴性对照,按照类器官培养的常规方法培养类器官。如有需要,可加入药物处理类器官。此外,如有必要,也可以设置类器官的浓度梯度,以便后续确定试剂盒的使用效果。

 

2、试剂准备:

 

1管冻干粉加入1管10mL buffer里,混匀避光待用。

 

注:溶解后尽快使用,-80℃,避光保存,有效期一个月。

 

1)溶解Organoid ATP发光法检测试剂,如有必要可适当分装该试剂;

2)按照96孔板每孔100μL(384孔板每孔25μL)的量,取适量Organoid ATP发光法检测试剂,平衡至室温。

 

3、类器官活力检测:

 

1)取出类器官培养板在室温平衡10min(通常不宜超过30min)

2)将96孔板每孔里的类器官培养基去除,每孔加入100μL Organoid ATP发光法检测试剂(384孔板每孔25μL); 注:无需去除基质胶。

3)室温剧烈振荡(微孔板恒温振荡器,推荐货号:abs72034)5min使类器官充分裂解;

4)室温(约25℃)孵育10min,使发光信号趋于稳定;

5)使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。请根据仪器要求设置相应的参数,每个孔的检测时间一般为0.25- 1s或更长时间,具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整;

6)根据化学发光读数直接计算类器官的相对活力,或根据ATP标准曲线计算出ATP的量从而计算出类器官的相对活力。

 

注:检测效果因类器官的种类不同而有所不同,对于一些ATP含量特别高的类器官,在细胞数量达到50,000个后可能会不呈线性相关,但化学发光读数还是会继续升高。

 

常见问题

 

1、荧光素酶的活性对温度比较敏感,所以反应前类器官和检测试剂均需平衡至室温后再进行测定。检测试剂请混匀后使用;

2、本试剂盒的检测试剂中含有荧光素酶,反复冻融会导致其逐渐失活。为取得良好的使用效果,第一次溶解后可适当分装保存,但需注意分装的容器不能有ATP污染;

3、待测药物的溶剂含量较高时可能会干扰荧光素酶反应,从而影响化学发光信号。可以通过设置含有溶剂的类器官培养液对照孔排除溶剂的干扰;

4、检测时须使用适合于类器官培养的白色或黑色的96孔板或384孔板。如果使用普通透明的96孔板或384孔板,相邻孔之间会产生相互干扰;

5、类器官接种密度,以24传96孔板为例。

传代前状态:24孔板,每孔25uL基质胶类器官凝聚物,500uL培养液

传代比例:类器官1:2传代

接种方式:24孔板传96孔板

96孔接种要求:每孔5uL基质胶类器官凝聚物,100uL培养液

接种孔数:24孔板收集3孔类器官传代,按1:2传代比例要传6孔,每孔点胶25uL,总点胶量6*25=150uL,此时传于96孔板,每孔点胶量5uL,总点孔数150/5=30孔


图 ICC(胆管癌)类器官96孔铺板密度图

 

检测案例

 

1、类器官药敏-人肝胆管癌(ICC)



 

结论:人肝胆管癌(ICC)类器官对Oxaliplatin、Lenvatinib、Larotrectinib、Regorafenib不敏感;对Cisplatin、Paclitaxel敏感

 

2、类器官药敏-人肺癌



 

结论:人肺癌类器官对drug1一般敏感; 对drug2敏感

 

3、类器官药敏-人胰腺癌


 

结论:人胰腺癌类器官对Irinotecan、Oxaliplatin一般敏感;对Paclitaxel、Gemcitabine敏感;两个病人表现出的药敏效果一致。

 

4、类器官药敏-人胰腺癌



 

结论:人胰腺癌类器官对Larotrectinib、Oclacitinib、Lenvatinib、5-Fluorouracil不敏感一般敏感;两个病人表现出的药敏效果一致。

 

今天讲解就到这了,大家如有类器官活力检测问题,欢迎入群交流哦!


 

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货号

品名

规格

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