全国服务咨询热线:

article技术文章
首页 > 技术文章 > 干货 | 不同类型样本RNA提取选择指南

干货 | 不同类型样本RNA提取选择指南

更新时间:2024-02-06      点击次数:575

背景

 

核糖核酸(RNA)是生命科学“中心法则"的三大核心分子之一,它主要以DNA的一条链为模板,以碱基互补配对原则,转录形成的一条单链分子。RNA的主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达,是遗传信息传递过程中的桥梁。


图 中心法则

 

RNA根据结构和功能的不同,又可以分为mRNA、rRNA、tRNA以及一些小分子RNA等。

 

表1 不同种类RNA


RNA种类

功能

mRNA

信使mRNA,编码蛋白质

rRNA

核糖体RNA,占75-85%,形成核糖体的基本结构并催化蛋白质的合成

tRNA

转运RNA,参与蛋白质合成的主要RNA,充当mRNA和氨基酸之间的转换器

miRNA

微小RNA,降解mRNA或阻碍其翻译,调节其他基因表达

snRNA

小核RNA,是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体的主要成分,在RNA转录后加工具有重要作用

lncRNA

长链非编码RNA,在表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等生命活动中发挥重要作用




 

RNA提取

 

核酸提取在核酸分子检测领域是及其关键的一步。对于RNA提取方法研究,具有较为悠久的发展历史,形成了多种总RNA提取方法,如异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法(Trizol抽提法)、碱裂解法、柱层析法、磁珠法等。

 

1)柱层析法:通过特殊的硅膜柱吸附RNA,通过洗脱实现RNA的提取。这种方法操作简单、核酸提取得率高,是目前实验室常用的RNA提取方法;

2)磁珠法:采用吸附RNA,通过磁场来分离RNA。这种方法操作简单,且可以实现全自动核酸提取,非常适合大批量RNA提取。

 

各种提取方法各有优缺点,需根据不同样本类型以及实验需求来选择。

 

AG8亚国服务明星产品Trizol(abs60154)是基于异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法的细胞或组织总RNA抽提试剂,对动植物细胞或组织及细菌的总RNA抽提均适用。提取所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值为1.8-2.0,同时可以保持样本中RNA的完整性,适用于多种下游实验。

 

产品优点

 

1)操作简单快速;
2)能抽提多种属总RNA;
3)能抽提不同分子量大小的多种RNA;
4)能够避免DNA和蛋白的污染;
5)RNA得率高、纯度高;
6)抽提出来的RNA适用于多种实验。

 

图 Trizol(abs60154)引用文献展示

 

经常会有客户来咨询是否能用Trizol进行血液RNA提取,本期给大家介绍下以Trizol法提取血液样本RNA实验操作。

 

实验原理

 

Trizol试剂是一个包含酚、异硫氰酸胍和SDS的单相酸性溶液,其在裂解细胞的同时抑制RNase的活性,随后加入氯仿,酚会大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同,造成DNA分布在下层的氯仿酚溶液中,RNA则分布在上层的水相中,最后用异丙醇沉淀水相中的RNA,并用70%乙醇洗涤沉淀,这样就可以得到比较纯净的总RNA。 


图 Trizol提取RNA流程图

 

实验步骤

 

1、所需试剂、耗材设备

 

Trizol(abs60154)、无酶无菌水(abs9259)、氯仿、异丙醇、75%乙醇、无菌无酶离心管(abs7119)、无菌无酶吸头(abs7072、abs7075、abs7081)、低温离心机

 

1)取300-500μL新鲜全血加入装有1mL Trizol的2mL离心管中(样品体积一般不超过Trizol体积的10%),充分吹打均匀;
2)室温静置5min,使核酸蛋白质复合物分离。(此时的样品可在-80℃冰箱中长期保存);
3)每1mL Trizol加入0.2mL氯仿,盖紧管盖,剧烈振荡15s,室温放置2-3min;
4)4℃ 12000xg离心15min,样品会分成三层:桔黄色的下层有机相,中间层和无色的上层水相;
5)吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中,吸取水相的体积为所加Trizol试剂的60%;
6)按照每1mL Trizol的最初使用量加入0.5mL异丙醇,颠倒数次混匀,室温放置10min;
7)4℃ 12000xg离心10min,弃除上清,可见胶状的RNA沉淀;
8)按照每1mL Trizol的最初使用量加入1mL 75%乙醇,颠倒数次混匀,洗涤沉淀;
9)4℃ 12000xg离心5min,弃除上清;
10)室温倒置5-10min晾干或真空抽干(不要使用真空干燥离心机,以免RNA过干,难以溶解);
11)加入适量(如25uL)无酶无菌水(abs9259)或TE缓冲液,用加样器吹打数次溶解RNA;
12)所得的RNA应立即使用或适量分装后-80℃保存,避免反复冻融。

 

注:对于其他样本如动植物细胞、组织、酵母细胞以及细菌请参考AG8亚国服务说明书

 

2、RNA质量检测方法

 

为了保证下游分子生物学实验的正常进行,需要对提取好的RNA质量进行检测。一般需要检测RNA纯度、浓度、完整性。

 

3、RNA浓度检测

 

可以使用NanoDrop超微量分光光度计和Qubit系列荧光计检测提取的RNA浓度。使用分光光度计检测可以记录各RNA样品的浓度及OD260/OD280、OD260/OD230的比值。RNA的浓度是衡量所提取的RNA质量高低的重要标准,若RNA的浓度较低,则影响后续分子生物学试验。

 

4、RNA纯度检测

 

RNA的OD值是衡量RNA纯度高低的一个重要指标,较为理想的总RNA的OD260/OD280比值应为1.8~2.1,当OD260/OD280的值小于1.8时,说明RNA中存在较多的污染,这种污染可能是蛋白质或者其他杂质。当OD260/OD280的值大于2.2时,说明RNA已部分降解。OD260/OD230的值作为参考,一般大于2.0较好。若OD260/OD230的值低于2.0,则说明提取的RNA有污染,这种污染一般来自蛋白质、盐类或次生代谢物。

 

5、RNA完整性检测

 

取提取的RNA样品5µL,与1µL 5×RNA Loading Buffer混匀后,在100-120V电压条件下,经1%的琼脂糖凝胶电泳30min。电泳结束后,经凝胶成像系统检查RNA电泳条带的完整性。

 

琼脂糖凝胶电泳条带的质量是评估提取的总RNA完整性快捷的方法,一般电泳条带的亮度与提取的RNA浓度成正比。对于真核生物样品,完整的总RNA在进行变性凝胶电泳时会产生清晰的28S和18S rRNA条带,两条带的亮度比约为2:1,并且可以观察到5S rRNA条带。


图 总RNA电泳结果

 

其他RNA提取产品

 

为了满足不同客户分子实验需求,AG8亚国服务研发有针对不同样本如动植物组织和细胞、血液、病毒、微生物的RNA提取试剂盒,同时进行了RNA提取方法学区分。我们拥有的优势有:

 

1)产品种类丰富;
2)产品安全性高;
3)RNA提取纯度高;
4)RNA提取得率高;
5)操作简便快捷;
6)专业售前售后技术支持。

 

对于特殊、珍贵样本,我们建议选择用针对不同样本类型的专项试剂盒。可以根据以下表格指南进行选择。

 

表 RNA提取试剂盒选择指南


样本类型

货号

产品名称

规格

通用

abs60154

Trizol

500mL

abs60026

超纯总RNA快速提取试剂盒(含DNase I)

50T

液体样本

abs60025

液体样本RNA抽提试剂

50mLx2

组织

abs60284

组织RNA提取试剂盒

100T

abs60027

组织/细胞RNA快速提取试剂盒(含Dnase I)

50T

细胞

abs60368

微量细胞RNA提取试剂盒

100T

abs60286

细胞RNA提取试剂盒

100T

FFPE样本

abs60302

石蜡包埋组织RNA提取试剂盒

100T

血液

abs60029

全血RNA快速提取试剂盒(含Dnase I)

50T

abs60280

小量血液RNA提取试剂盒

100T

abs60567

血液RNA提取试剂盒(磁珠法)

100T

abs60282

中大量血液RNA提取试剂盒

80T

拭子

abs60288

拭子RNA提取试剂盒

100T

粪便

abs60290

粪便RNA提取试剂盒

100T

尿液

abs60292

尿液RNA提取试剂盒

100T

abs60294

中大量尿液RNA提取试剂盒

60T

病毒

abs60030

病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒

50T





 

好消息!Absin文献奖励重磅升级!

 


Absin特色产品线:

WB相关:ECL发光液、预染marker、预制胶;IHC相关:二抗试剂盒、组化笔;IP/CoIP试剂盒;激动剂/抑制剂;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡试剂盒;呼吸爆发试剂盒;ELISA试剂盒;重组蛋白;抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体;定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...

AG8亚国服务(上海)生物科技有限公司
地址:上海市浦东新区新浩路58号申江科创园18栋
邮箱:wulan@absin.cn
传真:
关注我们
欢迎您关注我们的微信公众号了解更多信息:
欢迎您关注我们的微信公众号
了解更多信息