干货 | 不同类型样本RNA提取选择指南

背景

核糖核酸(RNA)是生命科学“中心法则"的三大核心分子之一，它主要以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录形成的一条单链分子。RNA的主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息传递过程中的桥梁。

图 中心法则

RNA根据结构和功能的不同，又可以分为mRNA、rRNA、tRNA以及一些小分子RNA等。

表1 不同种类RNA

RNA提取

核酸提取在核酸分子检测领域是及其关键的一步。对于RNA提取方法研究，具有较为悠久的发展历史，形成了多种总RNA提取方法，如异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法（Trizol抽提法）、碱裂解法、柱层析法、磁珠法等。

1）柱层析法：通过特殊的硅膜柱吸附RNA，通过洗脱实现RNA的提取。这种方法操作简单、核酸提取得率高，是目前实验室常用的RNA提取方法；

2）磁珠法：采用吸附RNA，通过磁场来分离RNA。这种方法操作简单，且可以实现全自动核酸提取，非常适合大批量RNA提取。

各种提取方法各有优缺点，需根据不同样本类型以及实验需求来选择。

AG8亚国服务明星产品Trizol(abs60154)是基于异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法的细胞或组织总RNA抽提试剂，对动植物细胞或组织及细菌的总RNA抽提均适用。提取所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值为1.8-2.0，同时可以保持样本中RNA的完整性，适用于多种下游实验。

产品优点

1）操作简单快速；
2）能抽提多种属总RNA；
3）能抽提不同分子量大小的多种RNA；
4）能够避免DNA和蛋白的污染；
5）RNA得率高、纯度高；
6）抽提出来的RNA适用于多种实验。

图 Trizol(abs60154)引用文献展示

经常会有客户来咨询是否能用Trizol进行血液RNA提取，本期给大家介绍下以Trizol法提取血液样本RNA实验操作。

实验原理

Trizol试剂是一个包含酚、异硫氰酸胍和SDS的单相酸性溶液，其在裂解细胞的同时抑制RNase的活性，随后加入氯仿，酚会大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下层的氯仿酚溶液中，RNA则分布在上层的水相中，最后用异丙醇沉淀水相中的RNA，并用70%乙醇洗涤沉淀，这样就可以得到比较纯净的总RNA。 

图 Trizol提取RNA流程图

实验步骤

1、所需试剂、耗材设备

Trizol(abs60154)、无酶无菌水(abs9259)、氯仿、异丙醇、75%乙醇、无菌无酶离心管(abs7119)、无菌无酶吸头(abs7072、abs7075、abs7081)、低温离心机

1）取300-500μL新鲜全血加入装有1mL Trizol的2mL离心管中（样品体积一般不超过Trizol体积的10%），充分吹打均匀；
2）室温静置5min，使核酸蛋白质复合物分离。（此时的样品可在-80℃冰箱中长期保存）；
3）每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡15s，室温放置2-3min；
4）4℃ 12000xg离心15min，样品会分成三层：桔黄色的下层有机相，中间层和无色的上层水相；
5）吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中，吸取水相的体积为所加Trizol试剂的60％；
6）按照每1mL Trizol的最初使用量加入0.5mL异丙醇，颠倒数次混匀，室温放置10min；
7）4℃ 12000xg离心10min，弃除上清，可见胶状的RNA沉淀；
8）按照每1mL Trizol的最初使用量加入1mL 75%乙醇，颠倒数次混匀，洗涤沉淀；
9）4℃ 12000xg离心5min，弃除上清；
10）室温倒置5-10min晾干或真空抽干（不要使用真空干燥离心机，以免RNA过干，难以溶解）；
11）加入适量（如25uL）无酶无菌水(abs9259)或TE缓冲液，用加样器吹打数次溶解RNA；
12）所得的RNA应立即使用或适量分装后-80℃保存，避免反复冻融。

注：对于其他样本如动植物细胞、组织、酵母细胞以及细菌请参考AG8亚国服务说明书

2、RNA质量检测方法

为了保证下游分子生物学实验的正常进行，需要对提取好的RNA质量进行检测。一般需要检测RNA纯度、浓度、完整性。

3、RNA浓度检测

可以使用NanoDrop超微量分光光度计和Qubit系列荧光计检测提取的RNA浓度。使用分光光度计检测可以记录各RNA样品的浓度及OD260/OD280、OD260/OD230的比值。RNA的浓度是衡量所提取的RNA质量高低的重要标准，若RNA的浓度较低，则影响后续分子生物学试验。

4、RNA纯度检测

RNA的OD值是衡量RNA纯度高低的一个重要指标，较为理想的总RNA的OD260/OD280比值应为1.8~2.1，当OD260/OD280的值小于1.8时，说明RNA中存在较多的污染，这种污染可能是蛋白质或者其他杂质。当OD260/OD280的值大于2.2时，说明RNA已部分降解。OD260/OD230的值作为参考，一般大于2.0较好。若OD260/OD230的值低于2.0，则说明提取的RNA有污染，这种污染一般来自蛋白质、盐类或次生代谢物。

5、RNA完整性检测

取提取的RNA样品5µL，与1µL 5×RNA Loading Buffer混匀后，在100-120V电压条件下，经1%的琼脂糖凝胶电泳30min。电泳结束后，经凝胶成像系统检查RNA电泳条带的完整性。

琼脂糖凝胶电泳条带的质量是评估提取的总RNA完整性快捷的方法，一般电泳条带的亮度与提取的RNA浓度成正比。对于真核生物样品，完整的总RNA在进行变性凝胶电泳时会产生清晰的28S和18S rRNA条带，两条带的亮度比约为2:1，并且可以观察到5S rRNA条带。

图 总RNA电泳结果

其他RNA提取产品

为了满足不同客户分子实验需求，AG8亚国服务研发有针对不同样本如动植物组织和细胞、血液、病毒、微生物的RNA提取试剂盒，同时进行了RNA提取方法学区分。我们拥有的优势有：

1）产品种类丰富；
2）产品安全性高；
3）RNA提取纯度高；
4）RNA提取得率高；
5）操作简便快捷；
6）专业售前售后技术支持。

对于特殊、珍贵样本，我们建议选择用针对不同样本类型的专项试剂盒。可以根据以下表格指南进行选择。

表 RNA提取试剂盒选择指南

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