线粒体功能障碍 | ATP检测助力糖尿病心肌缺血-再灌注(MI/R)发病机制研究

2型糖尿病(T2D)是一种全球性威胁，影响着全球数百万人。T2D是心肌梗死的一个重要风险因素，导致心肌血运重建后严重的左心室功能障碍，增加缺血-再灌注(I/R)损伤的风险，并使疾病发展复杂化。糖尿病心肌损伤加重的原因尚待阐明，线粒体功能损伤一直是研究的焦点。

有研究表明T2D增加心肌缺血-再灌注(MI/R)损伤易感性的机制包括：①T2D本身触发高血糖和胰岛素抵抗；②在缺血和再灌注期间诱导的氧化应激和炎症的释放。这两者都导致线粒体功能障碍。尽管越来越多的证据表明线粒体功能障碍与其在T2D MI/R病理生理学中的作用有关，但通过靶向线粒体来对抗这种疾病的有效治疗策略尚未实施。

图1  糖尿病MI/R损伤发病机制研究图形摘要^[1]

2023年8月3日，武汉大学人民医院夏中元教授团队在Cell Communication and Signaling上发表题为“Decreased MFN2 activates the cGAS-STING pathway in diabetic myocardial ischaemia-reperfusion by triggering the release of mitochondrial DNA"的研究论文。他们采用高脂饮食(HFD)加小剂量链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病小鼠模型，心肌缺血2h再灌流30min建立MI/R模型，高糖(HG)和棕榈酸(PA)诱导H9C2细胞糖脂毒性的细胞模型。研究阐明了cGAS-STING激活在糖尿病MI/R损伤的发病机制中的关键作用，该激活是由线粒体融合减少引起的胞浆线粒体DNA增加所触发的。

图2  rAAV-MFN2过表达调控糖尿病MI/R小鼠线粒体动力学和功能。C：线粒体形态变化；E-H：心肌细胞总ATP生成量及COX Ⅰ、COX Ⅱ、COX Ⅴ活性^[1]。

夏中元教授团队的研究结论为糖尿病MI/R损伤的治疗提供了临床前的见解。研究中，心肌细胞总ATP的检测与定量使用了AG8亚国服务（上海）生物科技有限公司提供的ATP Microplate Assay Kit。

ATP检测试剂盒(abs580117)使用方法介绍

适用范围：尿液、血清、血浆、组织提取物、细胞裂解物、细胞培养上清和其他生物液体样品

检测原理：

三磷酸腺苷(ATP)是细胞代谢的化学能，通常被称为细胞的“能量货币"。ATP只在光合作用和细胞呼吸过程中产生，并在生物合成反应、运动和细胞分裂等细胞过程中消耗。它是细胞活动的关键指标，在研究和药物开发中被用作衡量细胞活性和细胞毒性的指标。

ATP检测试剂盒是一种灵敏的测定各种样品中三磷酸腺苷的方法。三磷酸腺苷浓度由肌酸激酶和肌酸决定。反应产物可以在660nm的比色读数下测量。

备注：

1、反应后溶液应呈现黄色。如果没有颜色，说明实验失败。如果呈蓝色，则说明溶液受到污染。为了防止磷污染，最好使用一次性塑料容器来配制溶液。
2、Enzyme：使用前加入1mL蒸馏水溶解。
3、Substrate：使用前加入6mL蒸馏水并加热至溶解。
4、Standard：使用前加入1mL蒸馏水充分溶解，然后取500μL加入500μL蒸馏水中，获得浓度为5mmol/L的标准溶液。
5、Dye Reagent Working Solution：分别取5mL Dye Reagent Ⅲ加入到Dye Reagent Ⅰ中，1mL Dye Reagent Ⅲ加入到Dye Reagent Ⅱ中充分溶解。将所有Dye Reagent Ⅱ转移到Dye Reagent Ⅲ中充分混合，然后将所有Dye Reagent Ⅰ转移到Dye Reagent Ⅲ中（必须遵循这一步骤）。混合的染料试剂可在4℃保存2-3天。

实验步骤：

一、试剂和材料

1、自备试剂：蒸馏水
2、自备材料：酶标仪、移液器与枪头、离心管、离心机、计时器、湿冰等。

二、样品处理

1、细胞/细菌样品：将细胞或细菌（5×10⁶个）收集到离心管中，离心后去掉上清液，加入1mLAssay buffer，超声处理（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次），在4℃、8000g下离心10min，将上清液转移至新的离心管中，置于湿冰上待检测；
2、组织样品：称取1g组织，加入1mL Assay Buffer进行超声匀浆（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）后，在4℃、8000g下离心10min，将上清液转移至新的离心管中，置于湿冰上待检测；
3、血清/血浆样品：直接置于湿冰上待检测。

三、标准曲线制备

用蒸馏水对试剂盒提供的标准品（2.5mmol/L）进行2倍连续稀释，形成标准曲线。

四、样品预实验

对于未知的样品，浓度可能在很大的范围内变化。建议多做几个稀释梯度进行预实验，以确保读数在标准曲线范围内。

五、样品检测

使用前将所有试剂加热至37℃。按照以下方式加样并充分反应，最后用酶标仪在660nm下检测吸光值。

六、样品浓度计算

样品浓度计算试剂盒说明书中提供两种计算方式：①标准曲线法；②公式法。

针对说明书既有计算公式又有标曲的试剂盒，两种方式任选一种就可以，公式是简便算法。建议按照标曲计算，虽然比较麻烦且耗费试剂，但检测结果会更加准确。按照标曲计算，每一次都需要重新做标曲，因为这种反应是一个变化的过程，检测的数值会随着反应时间、温度等产生变化。

图3  ATP检测标准曲线示例（检测限：0.02mmol/L - 2.5mmol/L）

常见问题解答

Q1：我的样本是组织，按照说明书提供的样品处理方法收集上清进行检测，如何确认上清稀释倍数？

A1：由于待测样品的ATP含量未知，建议选取合适的样品点（2-3个）做预实验以确定稀释倍数。

Q2：说明书中提到混合后的染料试剂可在4℃ 保存2-3天，我要在2-3天内把实验做完吗？

A2：试剂盒中染料(Dye)溶解后易氧化变质，长时间储存会失效。建议老师多攒些样品一次性检测；如必须分次检测，可以考虑单买组分。

Q3：ATP检测试剂盒里面的检测板可以拆分吗？因为如果要做预实验摸索稀释倍数的话，可能只做几个孔。

A3：板子不能拆分，但是可以用常规的96孔酶标板替代做预实验。

[1] Xiong Y, Leng Y, Tian H, et al. Decreased MFN2 activates the cGAS-STING pathway in diabetic myocardial ischaemia-reperfusion by triggering the release of mitochondrial DNA[J]. Molecular biology reports, Cell Communication and Signaling, 2023,21:192.  
[2] Xu J, Xiong A, Wang X,et al.Hyperoside attenuates pyrrolizidine alkaloids-induced liver injury by ameliorating TFEB-mediated mitochondrial dysfunction[J]. Archives of Pharmacal Research, 2023, 46(8):694-712. 
[3] CaoM J, Huang X W, Zou J L, et al. Attenuation of Microglial Activation and Pyroptosis by Inhibition of P2X7 Pathway Promotes Photoreceptor Survival in Experimental Retinal Detachment[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2023, 64(7):1-14.
[4] YeB, Pei Y T, Wang L J, et al. NAD+ supplementation prevents STING-induced senescence in CD8+ T cells by improving mitochondrial homeostasis[J]. Journal of Cellular Biochemistry, 2024,1-17.

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