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线粒体功能障碍 | ATP检测助力糖尿病心肌缺血-再灌注(MI/R)发病机制研究

更新时间:2024-02-26      点击次数:392

2型糖尿病(T2D)是一种全球性威胁,影响着全球数百万人。T2D是心肌梗死的一个重要风险因素,导致心肌血运重建后严重的左心室功能障碍,增加缺血-再灌注(I/R)损伤的风险,并使疾病发展复杂化。糖尿病心肌损伤加重的原因尚待阐明,线粒体功能损伤一直是研究的焦点。

 

有研究表明T2D增加心肌缺血-再灌注(MI/R)损伤易感性的机制包括:①T2D本身触发高血糖和胰岛素抵抗;②在缺血和再灌注期间诱导的氧化应激和炎症的释放。这两者都导致线粒体功能障碍。尽管越来越多的证据表明线粒体功能障碍与其在T2D MI/R病理生理学中的作用有关,但通过靶向线粒体来对抗这种疾病的有效治疗策略尚未实施。


图1  糖尿病MI/R损伤发病机制研究图形摘要[1]

 

2023年8月3日,武汉大学人民医院夏中元教授团队在Cell Communication and Signaling上发表题为“Decreased MFN2 activates the cGAS-STING pathway in diabetic myocardial ischaemia-reperfusion by triggering the release of mitochondrial DNA"的研究论文。他们采用高脂饮食(HFD)加小剂量链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病小鼠模型,心肌缺血2h再灌流30min建立MI/R模型,高糖(HG)和棕榈酸(PA)诱导H9C2细胞糖脂毒性的细胞模型。研究阐明了cGAS-STING激活在糖尿病MI/R损伤的发病机制中的关键作用,该激活是由线粒体融合减少引起的胞浆线粒体DNA增加所触发的。


图2  rAAV-MFN2过表达调控糖尿病MI/R小鼠线粒体动力学和功能。C:线粒体形态变化;E-H:心肌细胞总ATP生成量及COX Ⅰ、COX Ⅱ、COX Ⅴ活性[1]

 

夏中元教授团队的研究结论为糖尿病MI/R损伤的治疗提供了临床前的见解。研究中,心肌细胞总ATP的检测与定量使用了AG8亚国服务(上海)生物科技有限公司提供的ATP Microplate Assay Kit。

 

ATP检测试剂盒(abs580117)使用方法介绍

 

适用范围:尿液、血清、血浆、组织提取物、细胞裂解物、细胞培养上清和其他生物液体样品

 

检测原理:

 

三磷酸腺苷(ATP)是细胞代谢的化学能,通常被称为细胞的“能量货币"。ATP只在光合作用和细胞呼吸过程中产生,并在生物合成反应、运动和细胞分裂等细胞过程中消耗。它是细胞活动的关键指标,在研究和药物开发中被用作衡量细胞活性和细胞毒性的指标。

 

ATP检测试剂盒是一种灵敏的测定各种样品中三磷酸腺苷的方法。三磷酸腺苷浓度由肌酸激酶和肌酸决定。反应产物可以在660nm的比色读数下测量。

 


试剂盒组分

规格

储存条件

96-Well Microplate

1 plate

Assay Buffer

30mL × 4

4 ℃

Enzyme

Powder × 1

-20 ℃,keep in dark

Reaction Buffer

1mL × 1

4 ℃

Substrate

Powder × 1

-20 ℃,keep in dark

Dye Reagent Ⅰ

Powder × 1

4 ℃

Dye Reagent Ⅱ

Powder × 1

4 ℃

Dye Reagent Ⅲ

10mL × 1

4 ℃

Standard

Powder × 1

-20℃

Plate Adhesive Strips

3 Strips

Technical Manual

1 Manual




 

备注:

1、反应后溶液应呈现黄色。如果没有颜色,说明实验失败。如果呈蓝色,则说明溶液受到污染。为了防止磷污染,最好使用一次性塑料容器来配制溶液。
2、Enzyme:使用前加入1mL蒸馏水溶解。
3、Substrate:使用前加入6mL蒸馏水并加热至溶解。
4、Standard:使用前加入1mL蒸馏水充分溶解,然后取500μL加入500μL蒸馏水中,获得浓度为5mmol/L的标准溶液。
5、Dye Reagent Working Solution:分别取5mL Dye Reagent Ⅲ加入到Dye Reagent Ⅰ中,1mL Dye Reagent Ⅲ加入到Dye Reagent Ⅱ中充分溶解。将所有Dye Reagent Ⅱ转移到Dye Reagent Ⅲ中充分混合,然后将所有Dye Reagent Ⅰ转移到Dye Reagent Ⅲ中(必须遵循这一步骤)。混合的染料试剂可在4℃保存2-3天。

 

实验步骤:

 

一、试剂和材料

 

1、自备试剂:蒸馏水
2、自备材料:酶标仪、移液器与枪头、离心管、离心机、计时器、湿冰等。

 

二、样品处理

 

1、细胞/细菌样品:将细胞或细菌(5×106个)收集到离心管中,离心后去掉上清液,加入1mLAssay buffer,超声处理(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次),在4℃、8000g下离心10min,将上清液转移至新的离心管中,置于湿冰上待检测;
2、组织样品:称取1g组织,加入1mL Assay Buffer进行超声匀浆(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次)后,在4℃、8000g下离心10min,将上清液转移至新的离心管中,置于湿冰上待检测;
3、血清/血浆样品:直接置于湿冰上待检测。

 

三、标准曲线制备

 

用蒸馏水对试剂盒提供的标准品(2.5mmol/L)进行2倍连续稀释,形成标准曲线。

 

四、样品预实验

 

对于未知的样品,浓度可能在很大的范围内变化。建议多做几个稀释梯度进行预实验,以确保读数在标准曲线范围内。

 

五、样品检测

 

使用前将所有试剂加热至37℃。按照以下方式加样并充分反应,最后用酶标仪在660nm下检测吸光值。

 


试剂

样品孔

标准品孔

空白孔

样品

20μL

标准品

20μL

蒸馏水

20μL

Substrate

60μL

60μL

60μL

Reaction Buffer

10μL

10μL

10μL

Enzyme

10μL

10μL

10μL

混合均匀,放入37°C烘箱中孵育30min。

Dye Reagent Working Solution

100μL

100μL

100μL

混合均匀,室温孵育10min后在660nm处检测吸光值。




 

六、样品浓度计算

 

样品浓度计算试剂盒说明书中提供两种计算方式:①标准曲线法;②公式法。

 

针对说明书既有计算公式又有标曲的试剂盒,两种方式任选一种就可以,公式是简便算法。建议按照标曲计算,虽然比较麻烦且耗费试剂,但检测结果会更加准确。按照标曲计算,每一次都需要重新做标曲,因为这种反应是一个变化的过程,检测的数值会随着反应时间、温度等产生变化。


图3  ATP检测标准曲线示例(检测限:0.02mmol/L - 2.5mmol/L)

 

常见问题解答

 

Q1:我的样本是组织,按照说明书提供的样品处理方法收集上清进行检测,如何确认上清稀释倍数?

A1:由于待测样品的ATP含量未知,建议选取合适的样品点(2-3个)做预实验以确定稀释倍数。

 

Q2:说明书中提到混合后的染料试剂可在4℃ 保存2-3天,我要在2-3天内把实验做完吗?

A2:试剂盒中染料(Dye)溶解后易氧化变质,长时间储存会失效。建议老师多攒些样品一次性检测;如必须分次检测,可以考虑单买组分。

 

Q3:ATP检测试剂盒里面的检测板可以拆分吗?因为如果要做预实验摸索稀释倍数的话,可能只做几个孔。

A3:板子不能拆分,但是可以用常规的96孔酶标板替代做预实验。

 


ATP检测试剂盒引用文献


[1] Xiong Y, Leng Y, Tian H, et al. Decreased MFN2 activates the cGAS-STING pathway in diabetic myocardial ischaemia-reperfusion by triggering the release of mitochondrial DNA[J]. Molecular biology reports, Cell Communication and Signaling, 2023,21:192.  
[2] Xu J, Xiong A, Wang X,et al.Hyperoside attenuates pyrrolizidine alkaloids-induced liver injury by ameliorating TFEB-mediated mitochondrial dysfunction[J]. Archives of Pharmacal Research, 2023, 46(8):694-712. 
[3] CaoM J, Huang X W, Zou J L, et al. Attenuation of Microglial Activation and Pyroptosis by Inhibition of P2X7 Pathway Promotes Photoreceptor Survival in Experimental Retinal Detachment[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2023, 64(7):1-14.
[4] YeB, Pei Y T, Wang L J, et al. NAD+ supplementation prevents STING-induced senescence in CD8+ T cells by improving mitochondrial homeostasis[J]. Journal of Cellular Biochemistry, 2024,1-17.

 

ATP系列试剂盒推荐:


货号

产品名称

规格

检测范围

abs580117

ATP Microplate Assay Kit

96T

0.02mmol/L - 2.5mmol/L

abs580019

Na+/K+ ATPase Microplate Assay Kit

96T

0.01μmol/L - 5μmol/L

abs580020

Ca2+/Mg2+ ATPase Microplate Assay Kit

96T

0.01μmol/L - 5μmol/L




 

其他生化检测试剂盒推荐:


货号

产品名称

规格

检测范围

abs580002

谷丙转氨酶(ALT)检测试剂盒

96T

0.625μmol/mL - 20μmol/mL

abs580004

谷草转氨酶(AST)检测试剂盒

96T

0.625μmol/mL - 20μmol/mL

abs580006

谷胱甘肽检测试剂盒

96T

0.01mmol/L - 0.5mmol/L

abs580066

羟脯氨酸检测试剂盒

96T

2μmol/L - 200μmol/L

abs580072

己糖激酶检测试剂盒

96T

4μmol/L - 400μmol/L

abs580073

丙酮酸激酶检测试剂盒

96T

4μmol/L - 400μmol/L

abs580074

磷酸果糖激酶检测试剂盒

96T

4μmol/L - 400μmol/L

abs580085

甘油三酯(TG)检测试剂盒

96T

0.1mmol/L - 5mmol/L

abs580107

磷离子检测试剂盒

96T

0.01mmol/L - 0.4mmol/L

abs580111

血红蛋白检测试剂盒

96T

1μg/mL - 100μg/mL

abs580119

α酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)检测试剂盒

96T

4μmol/L - 400μmol/L

abs580140

铜离子检测试剂盒

96T

1μmol/L - 250μmol/L

abs580156

异柠檬酸脱氢酶检测试剂盒

96T

0.2mmol/L - 20mmol/L

abs580197

尿素氮(BUN)检测试剂盒

96T

0.05mmol/L - 1mmol/L

abs580199

肌酐检测试剂盒

96T

0.05 mmol/L - 5 mmol/L

abs580222

牛磺酸检测试剂盒

96T

0.1mmol/L - 10mmol/L

abs580226

辅酶Q10检测试剂盒

96T

0.1mmol/L - 10mmol/L




 

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