多重荧光免疫组化Q&A（第四弹）

简介

多重荧光免疫组化技术（简称多色）基于酪氨酸信号放大 (Tyramide dignal amplification，TSA) 技术，是一类利用辣根过氧化酶 (HRP) 对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。

带有染料标记的底物酪胺分子在过氧化氢氧化环境下，被抗体或探针固定的HRP转化为具有短暂活性的中间状态，然后被激活的中间态分子迅速与相接蛋白分子的富含电子区域（酪氨酸残基）进行稳定的共价结合。

图1 酪胺Tyramide的过氧化物酶反应

为什么选择多色？多色技术的优点

1、同时标记多种蛋白（最多9标10色）；

2、一抗来源不再受限（同种属多标）；

3、连接辣根过氧化物酶的同种属二抗；

4、强荧光防淬灭。

本期主要讲解客户对说明书的一些疑惑，说明书常见问题一网打尽！！！

图2 AG8亚国服务多色试剂盒

重要提示！！！

新的一年AG8亚国服务部分多色试剂盒染料和抗体更新，例如旧版本TSA520外观是白色透明，新版本是黄色，老用户不要误会染料质量问题！

版本更新之后，新旧试剂盒请不要掺杂，试剂盒需配套使用！

图3 新版染料TSA520

AG8亚国服务多色试剂盒说明书问题解析

1、脱蜡水合步骤中“10%中性福尔马林浸片10min，灭菌水洗片1min，重复3次"目的是什么？我们以前做石蜡切片的时候没有这一步。

答：这是后固定的步骤，固定充分的组织可以省略此步。

2、微波修复抗原每一轮染色都要做吗？可以用抗体洗脱液替代吗？抗体洗脱液用在哪个步骤？

答：染第一个抗体之前做抗原修复，是为了使被石蜡或者固定剂封闭的抗原决定簇重新暴露出来，使得抗体能够识别到抗原；在染后面每一个抗体之前的抗原修复，目的是为了去除掉上一轮染色的抗体和残留没有结合上的染料，其实更准确的叫法是“抗体洗脱"，也就是说第一次的抗原修复是真正的抗原修复，后面的抗原修复实际上是“抗体洗脱"，“抗体洗脱"可以用抗体洗脱液(abs994)替换，特别是细胞、冰冻切片或者骨样本，但第一次抗原修复不能被抗体洗脱液替代，冰冻切片可以不进行抗原修复，染色效果欠佳时，可以考虑尝试进行抗原修复，推荐冰冻切片快速抗原修复液(5×)(abs9207)。

3、需要进行内源性过氧化氢封闭吗？在哪一步进行？是每轮都要做吗？

答：需要进行内源性过氧化氢封闭，详细的步骤是在血清封闭之前，3%的过氧化氢甲醇溶液室温封闭10-15min，PBST洗三遍，再加血清封闭，过氧化氢封闭做一次就好了。

4、染DAPI之前是否还需要进行抗原修复（指抗体洗脱）？

答：理论上是需要的，但是如果是冰冻切片经过多轮洗脱之后，有很大的脱片风险，这种情况下，宁愿背景不太干净，也不希望脱片，这一步可以不进行抗原修复。

多色试剂盒买二送一！！！ 活动时间：2024年2月20日-3月31日

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