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类器官原位活死染色实验攻略

更新时间:2024-04-30      点击次数:380

概述

 

在类器官的培养过程中,如果我们想了解类器官的增殖及凋亡状态,可以通过对活细胞和死细胞进行荧光染色,通过荧光显微镜拍照观察。

 

Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂,发绿色荧光 (Ex=490nm, Em=515nm)。因其在传统的Calcein(钙黄绿素)基础上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基团,增加了疏水性,使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后,Calcein-AM(本身不发荧光)被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein,从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂(如BCECF-AM和CFDA)相比,由于Calcein-AM细胞毒性极低,是很适合用于活细胞染色的荧光探针,而且不会抑制任何的细胞功能,如增殖和淋巴球的趋化性。        

 

由于死细胞缺乏酯酶,Calcein-AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此,Calcein-AM常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶(PI)等联合使用,同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶(Propidium iodide, PI)不能穿过活细胞的细胞膜,仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核,并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(Ex=535nm, Em=617nm),因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激发,因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545nm激发,仅可观察到死细胞。

 

原理

 

本试剂盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的双重染料,来进行活细胞和死细胞的双重染色标记,从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据我司优化的实验体系,以24孔板,每孔25uL类器官基质胶凝聚物为例,每孔添加500uL染色工作液进行染色

 

活细胞/死细胞双染试剂盒(abs50056)


组分

名称

规格

保存

A

Calcein-AM Solution(2mM)

50μL

-20℃避光干燥保存

B

PI Solution(1.5mM)

150μL

-20℃避光干燥保存

C

10×Assay Buffer 

50mL

-20℃保存,经常使用可放在4℃保存。




 

实验步骤

 

一、工作液的配制:

 

1、1×Assay Buffer(反应缓冲液)的配制 从低温冰箱内取出10×Assay Buffer,根据单次用量无菌条件取出适量,用去离子水(dH2O)做10倍稀释以得到1×Assay Buffer。

2、1×染色工作液的配制

(1)先将低温保存的Calcein-AM溶液(2mM)和PI溶液(1.5mM)回到室温20-30min。 注意:第一次使用可对母液进行分装,以减少反复冻融次数。

(2)取5μL Calcein-AM溶液(2mM)和15μL PI 溶液(1.5mM)加入5mL 1×Assay Buffer,充分混匀。此时得到Calcein-AM的工作液浓度为2μM,PI的工作液浓度为4.5μM。

注意:由于不同种类器官的最佳染色条件不同,初次实验建议做梯度实验,以确定Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用min的探针浓度得到较好的荧光结果。可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。

 

a. 用0.1%皂素或者0.1-0.5%digoxin孵育类器官1h,或者用70%乙醇孵育类器官1h,从而制备死类器官;

b. 用0.1-10μM的PI溶液进行死类器官染色,以得到仅仅对细胞核染色,而不会对细胞质染色的最佳工作浓度;

c. 用0.1-10μM的Calcein-AM进行死类器官染色,以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色,去观察活细胞是否能被染色。

 

二、染色步骤:

 

 以24孔板,每孔25uL类器官基质胶凝聚物为例,检测时只需弃除类器官培养液,保留孔板内25μL类器官基质胶凝聚物,加入染色工作液即可。

 

1、将类器官培养基吸弃,加入PBS清洗2-3遍,以充分去除残留的酯酶活性,然后弃除PBS;

2、每孔加入500μL染色工作液,混匀,37℃孵育1h

3、荧光显微镜下使用490±10nm激发滤片同时检测活细胞(黄绿色荧光)以及死细胞(红色荧光)。另外,使用545nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。

 

注意事项

1、由于Calcein-AM对湿度非常敏感,若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后,必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量,分装密封保存。

2、由于Calcein-AM的稳定性比较差,此染色工作液必须现配现用,并且在当天用完。

3、碘化丙啶(PI)有一定的致癌性,操作时一定要注意防护。若接触到皮肤,需要立即用自来水清洗。

4、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

染色效果图展示

 

一、人肝细胞癌类器官明场图




人肝细胞癌类器官扩增过程(由少到多)

 

二、人肝细胞癌类器官活死染色视频


 

三、人肝细胞癌类器官活死染色图


人肝细胞癌类器官活细胞、死细胞、活死细胞染色合并图


人肝细胞癌类器官活死细胞染色合并图

 

今天讲解就到这了,大家如有实验问题,欢迎私聊交流哦!

 

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