细胞氧化应激状态评价实验指南

一、什么是氧化应激状态？

机体代谢过程中活性氧不断地通过非酶促反应和酶促反应产生，每日约有1%-3%的摄入氧转变为超氧阴离子(superoxide anion, O₂ˉ•)及其活性衍生物，但在抗氧化酶以及外源性和内源性抗氧化剂的协同作用下被不断清除，在生理情况下，ROS的生成与清除处于动态平衡，活性氧可维持于有利无害的极低水平。由于内源性和（或）外源性刺激使机体代谢异常而骤然产生大量活性氧自由基，或机体抗氧化物质不足，氧化剂/抗氧化剂间平衡失常，则使机体处于氧化应激状态。当细胞处于氧化应激状态时，可氧化损伤生物分子，并进一步引起细胞死亡和组织损伤，与很多病理过程相关^[1]。

二、氧化应激状态评价方法

自由基的量可利用电子自旋共振法、化学发光法、化学捕获法等进行测量。由于自由基的反应活性较强而寿命短暂，并且其浓度非常低，要对其直接进行测量非常不方便。自由基主要氧化损伤DNA、脂质以及蛋白等生物分子，检测组织和生物体液中的氧化应激代谢产物对评价氧化应激状态尤其重要。

生物体内，除极微量的 ROS被机体利用外，几乎所有的ROS都应当及时被清除。特定ROS的生成过多又会引起机体产生相应的抗氧化物质消除多余ROS。生物体内防御ROS所致损伤的体系主要为抗氧化酶、抗氧化剂以及分隔过渡金属的蛋白，它们均可特异性地限制人体的氧化损伤。

1、DNA的氧化产物

引起DNA氧化损伤的ROS主要是•OH。•OH可攻击脱氧核糖，使脱氧戊糖分解、磷酸二酯键断裂，引起 DNA出现单链或双链断裂。此外，•OH加到DNA碱基的π键上，产生特异性的嘌呤和嘧啶碱基修饰物，受损的 DNA可由核酸内切酶和转葡糖基酶修复，并释放出脱氧核苷酸和游离碱基，例如鸟嘌呤(guanine, G)被氧化而生成8-oxo-G，在修复酶的作用下以8-OHdG形式被切除，从尿排出。尿中8-OHdG是“全身"DNA受氧化损伤后经切除修复而排出的量，可反映对氧化损伤的修复程度，因而8-OHdG被认为是内源性氧自由基引起DNA氧化损伤的一种标志。此外还有利用彗星法DNA损伤分析试剂盒(abs60590-75T)检测白细胞中氧化损伤引起DNA的断裂来评价患者的氧化应激状态。

2、脂质过氧化产物

生物膜脂质的磷脂中富含多不饱和脂肪酸(poly-unsaturated fatty acid, PUFA)在O₂存在条件下，极易被自由基及其活性衍生物攻击，引发脂质过氧化链式反应。同时在脂质过氧化过程中产生的LO•、LOO•、等也可产生链引发和链扩增反应。LOO•还可通过分子内双键加成，形成环过氧化物和环内过氧化物自由基，最后断裂为各种代谢产物。如过氧化脂质经脂氧基的β断裂可产生许多醛类，如丙二醛和4-羟烃烯。测定生物样品中的丙二醛(abs580011-96T)和4-羟壬烯均可反映脂质过氧化，有文献报道4-羟壬烯比丙二醛更能反映阿尔茨海默病患者的氧化应激状态^[2]。

3、抗氧化酶

在抗氧化防护体系中，主要的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, Cat)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)，可协助清除自由基，减轻和消除氧化损伤。在血浆、全血红细胞或血小板以及组织中有一种不含硒的GSH-Px，又称谷胱甘肽转硫酶(glutathioneS-transferase, GST)，可催化ROOH转变为ROH，协助GSH-Px清除体内的ROOH。此外，谷甘肽还原酶(glutathione reductase, GSH-Re)可借助NADPH 提供电子促进氧化型谷胱甘肽(oxidizedghutathione, CSSG)再生为还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)，因而在机体抗氧化作用中也有重要作用。

各种抗氧化酶从不同角度协助清除体内的ROS，在抗氧化过程中起着不同的作用，因而常测定血液中SOD(abs580010-96T)、Cat(abs580060-96T)、CSH-Px(abs580136-96T)以及GST(abs580046-96T)的量及活性来反映机体抗氧化活性，其中以SOD以及GSH-Px很受重视。

4、非酶抗氧化剂

非酶抗氧化剂非酶抗氧化剂主要是可清除自由基的低分子量物质，包括谷胱甘肽、抗氧化维生素(VitE, VitC)、泛醌还原物、金属硫蛋白及硫氧还蛋白等。

谷胱甘肽(glutathione, GSH)是一种3肽化合物(Glu-Cys-Gly)，是需氧生物中主要的非蛋白硫醇，细胞内其浓度在mM水平。GSH是一种抗氧化剂，而且GSH是多种酶如CSH-Px的辅酶，涉及多种生物学过程，参与清除•OH、HOC1、ONOO-、LO•、LOO•、O2ˉ•和H₂O₂等ROS，防护氧化应激对机体产生的损伤。 GSH(abs580006-96T)的量可在一定程度上反映机体的抗氧化能力。泛醌即CoQ₁₀(abs580226-96T)，是氧化磷酸化过程中线粒体呼吸链中必须的辅因子，其还原形式称为泛醇(CoQ₁₀H₂)，可与VitE(abs580153-96T)协同中止脂质过氧化链式反应，抑制脂质过氧化的启动和传播，还可防止血浆中脂蛋白以及生物膜中脂质过氧化。

5、总抗氧化能力

单独测定某一种或某些抗氧化成分的含量往往不能全面反映组织的抗氧化能力，且有时操作上较为困难和繁琐，因而可采用体液中的TAC(total antioxidant capacity)来评价机体总体上的抗氧化活性，这比测量已知的每一种抗氧化剂显得更为有效。血浆的TAC值(abs580109-96T)可反映体液中已知和未知的抗氧化剂的多少，被认为是反映氧化应激的一个较好的指标。然而，对此种测试结果进行解释时应当谨慎，因为在疾病中胆红素或尿酸盐的增加可掩盖其它抗氧化剂的缺失。如对于肾功能衰竭患者，由于尿酸亦有抗氧化作用，因而不能用TAC反映肾功能衰竭患者真正的抗氧化能力^[3]。

很多疾病均与氧化应激相关，但还不十分清楚氧化应激是疾病的原因还是疾病过程中的一种结果。目前评价氧化应激状态还缺乏一套可行的方法来反映不同的氧化应激状态与疾病过程的相关性。在疾病研究中最好同时运用多种检测手段，综合所得的相关信息以对氧化应激状态获得一个更清楚的认识。

三、氧化应激状态检测在疾病研究中的应用

2024年4月1日，武汉大学人民医院心血管内科万军教授团队在Biochemical Pharmacology杂志上发表了题为“IL-23p19 deficiency reduces M1 macrophage polarization and improves stress-induced cardiac remodeling by alleviating macrophage ferroptosis in mice"的研究论文，该研究探讨了IL-23p19是否调节心脏重塑过程并探讨其可能的机制。

研究人员采用横主动脉缩窄术构建小鼠心脏重构模型，并以假手术作为对照。结果显示，手术后心脏中IL-23p19表达增加，可能主要由心脏巨噬细胞产生。 IL-23p19的敲除减弱了M1巨噬细胞的极化，减少了铁死亡，改善了TAC小鼠的心脏重塑过程并减轻了心脏功能障碍。细胞培养实验发现，当添加去氧肾上腺素(PE, abs816245)时，巨噬细胞是铁死亡的主要原因，而铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1,abs813072)阻断铁死亡可显着抑制M1型巨噬细胞极化。 Fer-1治疗还改善了接受TAC手术的IL-23p19小鼠的心脏重塑并减轻了心脏功能障碍。最后，给予从WT小鼠分离的巨噬细胞的TAC IL-23p19小鼠表现出M1巨噬细胞比例增加和心脏重塑加剧，而当给予Fer-1时，这些影响被逆转。 IL-23p19的敲除可能会减弱M1巨噬细胞的极化，从而通过减少巨噬细胞铁死亡来改善心脏重塑过程，IL-23p19可能是预防和治疗心脏重塑的潜在靶点。

图1 用GSH检测试剂盒(abs580006-96T)、MDA检测试剂盒(abs580011-96T)测定大鼠血清中GSH和MDA的含量，结合SOD、LPO、ROS、组织铁含量等水平评估细胞氧化应激程度^[4]。

接下来，小爱就以脂质过氧化产物丙二醛 (MDA)检测试剂盒为例，给大家详细介绍试剂盒使用方法。

丙二醛检测试剂盒使用方法介绍

一、试剂盒组分

二、操作步骤

1、材料和试剂准备

自备材料：酶标仪（可在532nm处读取吸光值）、蒸馏水、移液器与枪头、研钵、离心机、计时器、湿冰等。

Dye Reagent A：使用前加入5mL蒸馏水，放入70℃的水浴中，充分溶解后使用；

Dye Reagent Working Solution：当Dye Reagent A冷却时，加入5mL染料试剂B，混合；

Standard：用乙醇连续2倍梯度稀释。

2、样本处理

1）细胞/细菌样本：将细胞/细菌(5×10⁶)收集到离心管中，离心后去掉上清液，加入1mL Assay buffer，超声处理（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）后于4℃ 8000g离心10min，上清液转移至新离心管中，湿冰上保存待检测。

2）组织样本：称取0.1g组织，加入1mL Assay buffer在湿冰上匀浆，4℃ 8000g离心10min，上清液转移至新离心管中，湿冰上保存待检测。

3）血清/血浆样本：直接检测。

3、上样及检测

按照如下表格顺序从上到下依次加样（注：不能混合在一起加样）：

注：1）对于标准品，可进行2倍连续稀释，制成标准曲线；

       2）对于未知的样品，我们建议挑选几个样品进行预实验，以确定样品浓度和稀释倍数。

4、标准曲线

标准曲线仅用于参考，每次实验都必须做一条新的标准曲线。

检测范围：0.01mmol/L-1mmol/L

常见问题解答

Q1：试剂盒中的96-Well Microplate只有一个，不够实验使用怎么办？

A1：该试剂盒中的96孔板是免费送的，后续实验可以用常规的96孔酶标板代替。

Q2：试剂盒操作说明书中既有标准曲线法又有公式法，我应该选择哪种计算方式？

A2：两种方式任选一种就可以，公式是简便算法，建议按照标曲计算，会更加准确。需要注意的是，使用标准曲线法，每次实验必须重新绘制标准曲线。

Q3：试剂盒一次用不完，最长能保存多久？

A3：试剂盒中染料(Dye)溶解后易氧化变质，需要现配现用，不建议储存。长期储存可能影响显色读数进而影响检测；如果样本需要分批检测，建议分批收样储存，待样本收齐后统一检测。此外，如因储存时间过久或其他人为原因导致组分不够使用，可与我司联系单独购买试剂盒组分。

[1] 王秋林,王浩毅,王树人.氧化应激状态的评价[J].中国病理生理杂志, 2005, 21(10):2069-2074.

[2] McGrath IT,MeGleenon BM,Brennan S,et al. Increasedoxidative stress in Alzheimer's disease as assessed with 4-hydroxynonenal but not malondialdehyde[J].Quarterly Journa)of Medicine,2001,94(9):485-490.

[3] Bergesio F, Monzani G, Ciuti R, et al. Total antioxidant ca-pacity(TAC):is it an effective method to evaluate the oxida-tive stress in uraemia? [J]. J Biolumin Chemilumin, 1998,13(5):315-319.

[4] Lu X, Ji Q, Pan H, et al. IL-23p19 deficiency reduces M1 macrophage polarization and improves stress-induced cardiac remodeling by alleviating macrophage ferroptosis in mice. Biochem Pharmacol. 2024,222:116072. doi:10.1016/j.bcp.2024.116072.

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