文献解析|一文读懂如何测杜氏肌营养不良症(DMD)患者中肌营养不良蛋白水平

标题：Absolute Quantification of Dystrophin Protein in Human Muscle Biopsies using Parallel Reaction Monitoring (PRM)

期刊：JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY

发表时间：2019年

摘要

杜氏肌肉营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)是一种发病率相对较高的单基因疾病，由X染色体上编码抗肌萎suo蛋白基因(Dystrophin)突变，导致无法产生足够的抗肌萎suo蛋白，患者的肌肉组织逐渐被脂肪和纤维化组织取代，大约每5000名新生男婴中就有1人患病。针对此疾病需要一种可靠和准确的方法来量化人类骨骼肌活检中的肌营养不良蛋白，这对于评估肌营养不良素替代疗法在Duchenne肌营养不良中的疗效以及深入了解肌营养不良水平与Becker肌营养不良疾病严重程度之间的关系至关重要。目前测量肌营养不良蛋白的方法，如蛋白质印迹和免疫荧光，虽然简单明了，但缺乏准确性，有时甚至缺乏特异性。本文通过采用标准化一种靶向质谱法，使用全长13C6-Arg、13C6、15N2-Lys标记的肌营养不良蛋白和平行反应监测(PRM)来测定肌肉中肌营养不良素的绝对量。该方法被发现是可重复的，定量极限低至每毫克总肌肉蛋白30pg的肌营养不良蛋白。然后对该方法进行测试，以测量来自健康捐赠者和Duchenne和Becker肌营养不良患者的肌肉活检中肌营养不良蛋白的水平。

引言

肌营养不良蛋白是维持肌纤维完整性和功能的肌营养不良相关蛋白复合物(DAPC)的重要成员。肌营养不良通过DAPC将肌纤维的细胞内肌动蛋白丝连接到细胞外基质，并在肌纤维收缩和松弛过程中稳定肌膜。缺乏肌营养不良蛋白质，如杜氏肌肉营养不良(DMD)或其异常的定性和定量表达如Becker氏肌营养不良症(BMD)，导致肌膜不稳定和肌纤维退化。DMD患者通常在20多岁时死亡，而BMD患者存活时间更长，但疾病严重程度和发病率不同。肌营养不良蛋白的数量和质量显著影响肌肉稳定性。在过去几年中，已经开发出了恢复DMD患者中缺失的肌营养不良蛋白的有希望的疗法，目前正处于II期和III期临床试验中。然而，使用这些疗法恢复的肌营养不良蛋白的量还没有很好的定义，这导致了关于肌营养不良蛋白的多少足以稳定肌膜和改善患者预后的相互矛盾的结论。此外，肌营养不良蛋白水平与BMD疾病严重程度之间的关系尚不清楚。量化骨骼肌组织中肌营养不良蛋白的准确方法对于作为既可以作为评估肌营养不良蛋白替代疗法疗效的药效学生物标志物，也可以作为评估疾病严重程度的替代生物标志物。

研究结果

01.测定SILAC标记肌管中肌营养不良蛋白的绝对量

使用含有不同百分比肌营养不良蛋白的SILAC肌管提取物刺入骨骼肌提取物的肌营养不良蛋白质的滴定曲线来测试该方法的线性。通过在含有可变比例的正常肌提取物与DMD肌提取物的骨骼肌提取物中加入SILAC肌管提取物来生成滴定曲线，生成两条滴定曲线以确定肌营养不良蛋白的线性和定量限度。

02.WB检测肌营养不良蛋白滴定曲线

WB检测结果显示肌营养不良蛋白427kDa， α-肌动蛋白(100kDa)用作上样对照，并检查其线性关系。

研究结论

在这项研究中，作者标准化了一种稳健可靠的靶向质谱法，以量化人体骨骼肌裂解物中肌营养不良蛋白的绝对量。研究发现该方法在宽动态范围内是线性的，并且与通过蛋白质印迹的相对定量相比更具可重复性。该方法还可用于量化和表征肌营养不良蛋白基因不同突变的BMD患者肌肉中的肌营养不良蛋白质，它可以精确地将这些突变映射到蛋白质中的必需和非必需结构域。该方法也可用于确定未来接受不同肌营养不良蛋白替代疗法的DMD患者中肌营养不良素的水平或恢复的肌营养不良因子。