细胞培养常见问题之血清篇

细胞培养是指在人工创造的与体内生长环境相似，如无菌条件、适宜的温度、pH、CO₂环境和适宜营养条件下，使细胞生长、繁殖并维持主要结构和功能的技术。

细胞培养是细胞生物学研究方法中很常用也是最重要的技术之一，在现代医学、生物科学、农业科学等领域被广泛应用以提供研究模型和实验材料。在细胞培养过程中，wan全培养基对细胞生长状态起到关键作用，决定实验成功与否。而血清是wan全培养基中的关键成分之一，除为细胞生长提供基本营养物质、结合蛋白、一些参与解毒代谢的微量元素和可起到中和保护的酶类之外，还可以保护细胞免受机械损伤，因此被业内认为是细胞增殖过程中最重要的试剂。在生命科学领域的细胞培养技术中，动物血清的应用十分广泛，特别是牛来源血清。而牛源血清又分为胎牛血清、新生牛血清和小牛血清，它们的区别方式主要由于牛龄和采血方式不同，其中胎牛血清因其抗体水平含量低对后续实验结果影响小、生长因子含量水平高利于细胞增殖而应用很广。因此关注胎牛血清的品级、质量以及使用过程的一些注意事项，会对实验结果起到直接影响作用，并可以确保科研人员在实验操作过程中的安全性。

今天我们就来看看在细胞培养过程中血清使用方面常见的问题，如：血清储存条件、如何程序解冻、细胞污染与血清之间的关系、传说中的“黑胶虫"是什么以及血清热灭活是否有必要等等，“工欲善其事，必先利其器"，通过今天的解析与学习可以让我们在做细胞培养相关实验时事半功倍！那我们就开始吧~

Q1：血清长期储存的条件和方法是什么？

A1：血清如需长期保存，则必须储存于-10℃或更低温冰箱中，建议存放于-20℃的冰箱中。研究表明储存在-80℃条件下的血清在性能方面变化不大，但由于解冻时温差过大，会导致析出更多沉淀，使得背景杂乱，因此血清长期保存不建议处于-80℃条件下。如果近期会频繁使用血清，我们建议不要在4℃条件下存放超过1个月，若一次无法用完整瓶建议分装后保存，且要避免反复冻融。另外，血清冰冻后体积会增加约10%，因此血清分装时请留意预留一定的体积空间。

Q2：如何进行血清的程序性解冻？血清才不会使产品质量受损？

A2：程序性解冻血清可以确保血清制品质量的稳定性，且不会因为温差过大而析出过多蛋白等沉淀。程序性解冻方法是于实验开始之前将冷冻的血清置于4℃冰箱中融解，并且在解冻过程中每隔1小时摇匀一次，使温度与成分均一，减少沉淀析出，直至全部解冻，然后再移入室温条件下使用。

Q3：血清解冻后发现絮状沉淀该如何处理？

A3：造成血清发生絮状沉淀的原因主要是血清解冻过程中温差带来了脂蛋白变性和纤维蛋白析出，沉淀本身不会影响血清质量，也不会对实验结果造成影响。但如必须处理沉淀，则可通过离心方式去除，如500-1000×g离心5-10min。

Q4：血清沉淀是什么？

A4：用于细胞培养的胎牛血清及其他血类制品中均存在各种类型的沉淀，如纤维蛋白和磷酸钙等。一些絮状沉淀主要就是纤维蛋白，通常我们肉眼可见，大小在1-2mm之间；而磷酸钙在显微镜下观察呈现布朗运动的小黑点，通常被误认为是微生物污染。血清沉淀往往比较难以预测和控制，但幸运的是这些沉淀不会影响血清品质。

Q5：血清中的小黑点是“黑胶虫"么？

A5：血清解冻过程温差过大、经反复冻融或通过热灭活处理后更容易产生沉淀，这些沉淀物在镜下观察时有一些会呈现以布朗运动的小黑点，业内流行一种“黑胶虫"污染的说法，但“黑胶虫"一直以来都是极为神秘的存在，至今科学家们也没有完整的实验结果可以证实它究竟是一种生物还是非生物，更有人认为“黑胶虫"是血清的原虫，或误以为是细菌或真菌污染。但科学家通过进一步的研究发现它们更可能是血清中的蛋白结晶。这种结晶可能为蛋白析出，如纤维蛋白原凝结成纤维蛋白；或是盐析出，如磷酸钙等；也有一些是胆固醇和脂肪酸。以下图片就证实了这一说法，如纤维蛋白和磷酸钙。

图1：上图分别为纤维蛋白在低倍镜和高倍镜下观察到的图像，下图为磷酸钙在低倍镜和高倍镜下观察到的图像（箭头指示的是我们看到的“黑点"）

Q6：如何判断血清污染？

A6：

（1）首先检查并判断外包装是否有破损，一般瓶身破损的血清发生污染的可能性极大；

（2）将血清接种到血酯板上，培养后看是否有菌落形成；

（3）可通过质量检测试剂盒检测结果判定，如支原体检测试剂盒等。血清污染主要包括细菌污染、真菌污染和支原体污染。在细胞培养时想要确定血清存在细菌污染，可尝试使用5-10倍浓度青链霉素双抗冲击培养24-48h；真菌污染的细胞无法抢救，应立即将细胞瓶进行高压灭菌处理，并消毒培养箱；支原体污染可考虑更换早期代次细胞，或使用商品化支原体去除试剂。

Q7：细胞形态不正常、生长状态异常或增殖速率缓慢是否与血清有关？

A7：细胞形态异常需要综合关注细胞代次、传代操作、培养基和血清等诸多因素。如传代次数过多或传代时间过晚都有可能影响细胞的生长状态。有些细胞对血清具有一定适应性，更换新批次血清时可能出现所含因子水平的差异而导致的细胞生长状态受到影响的现象，可以通过血清梯度替换或者增加细胞适应时间来解决此类问题。与此同时也要关注基础培养基和传代操作等方面是否存在一定问题。

Q8：如何做血清的梯度替换？

A8：当细胞培养实验需更换血清品牌时，做程序性梯度替换方案尤为重要，因为不同品牌的血清所含成分有所差异，血清更换会使细胞发生不适，从而出现细胞增殖缓慢或细胞状态不佳等情况。建议的梯度替换方法为：wan全培养基配置过程中先用25%新血清与75%原血清进行混合，培养传代1-2次；而后用50%新血清与50%原血清混合培养传代；再用75%新血清与25%原血清混合培养传代；最后wan全使用新血清培养传代。

Q9：培养基中添加血清和抗生素后可长期保存吗?

A9：新鲜培养基中添加血清和抗生素后，建议在2周内使用完。

Q10：血清的热灭活是必须的吗?

A10：实验表明，经热灭活处理的血清对细胞生长可能仅有微小促进或wan全没有任何作用，甚至通常因高温处理而损失掉血清中部分营养成分从而影响血清质量，造成细胞生长速率降低。热灭活过程中因局部温度过高、摇晃不均匀或灭活时间过长，都会造成血清品质下降，且经热灭活后的血清会增加发生蛋白沉淀概率。因此，若非必须血清不需要做热灭活，而少数对补体敏感的细胞实验，如某些免疫学实验或腺病毒包装等，可酌情对血清进行热灭活操作。

Q11：血清热灭活应如何操作？

A11：

（1）热灭活前，必须先将解冻后的血清摇匀，并恢复至室温；

（2）取部分摇匀血清置于50ml离心管中，并准备同规格对照管一个；

（3）对照管内加入血清等体积水；

（4）对照管内插入温度计进行温度预试，当温度达到56℃时将恢复至室温的血清放入水浴锅30min；

（5）灭活过程中需要每隔5min轻轻晃动摇匀，以保证温度均一。

Q12：血清为什么存在批间差？

A12：血清批间差是客观存在的，因为血清制品来源于天然活体，供体牛只的生理状况、健康状况均不同，且受饲养环境的地形、风貌、饮食、水源等影响，体内各类蛋白、生长因子和酶类的含量均有巨大差异，所以血清具有含量复杂且不固定的特性，批间差异在所难免，因此批间差异小的血清不仅可以保证血清质量，确保细胞培养效果，还能减少由于批间差异带来的使用前测试，且避免实验结果的不可重复性。

既然血清在细胞培养过程中如此重要，那么我们又该如何选择靠谱的血清呢？

1.中国海关允许进口的血源地

世界动物卫生组织（OIE）对国家或地区动物感染性疾病有相关评价指标，如疯牛病风险评价指标GBR就是根据疯牛病风险等级进行地域性风险评估及分类。目前世界上仅有一些少数国家在OIE对牛类风险性疾病的评估中符合中国海关要求，因此中国海关允许进口的血清来源地有澳大利亚、新西兰、乌拉圭，这些国家来源的牛血类制品的生物安全等级较高，科研人员在使用相关来源的血类制品时极大降低了感染疾病的风险。

2.血源可溯性

由于血清利润价值高昂、血源紧缺、不同原产国血清价格有差异、通过伪造血清来源从而进行利润赚取使血清用户深受困扰等原因，使得血源可溯源至关重要。目前血清行业中有Oritain指纹识别技术，该技术可为每批血清进行来源溯源认证，有效证实血清产品来源。

3.国际机构认证

国际血清行业协会（ISIA）成立于2006年6月，旨在建立全球动物血清和动物源性产品质量标准，促进和确保血清和动物源性产品供应符合标准和伦理规范，现已成为血清行业规范及血清供应商身份验证标准的制定者。ISIA实施了供应链可追溯性的行业标准，这对确保血清各个批次的质量、安全性和重复性起了关键作用。该组织在胎牛血清生产过程中主要对原料采集、血清加工、产品质检和出国运输等环节进行监控及认证。

4.进口合规性

合规的进口血清应该具备多项资质证明文件，包括原产地证明、卫生证/健康证/农业部非疫区证明、进口货物报关单以及入境货物检验检疫证明。其中原产地证明（CERTIFICATE OF ORIGIN）可以追溯货物原产地或制造地，卫生证/健康证/农业部非疫区证明（ HC, HEALTH CERTIFICATE, TES/BSE）可以确保血清供体来源是健康、非疫区和无传染病的。

5.严格质控

由于牛血清在人用疫苗和兽用疫苗等生物制药生产中非常重要，很多国家都将其纳入药典，在我国的中华人民共和国药典Ch.P、美国药典USP和欧洲药典EP中都规定了牛血清的定义和质量标准，如内毒素、总蛋白含量、血红蛋白、PH、微生物、免疫球蛋白、抗生素等。此外，9种牛类传染性疾病的检测结果也十分重要，分别是牛呼吸道融合病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、 牛细小病毒(BPV)、蓝舌病毒(BTV)、 牛腺病毒(BAdV)、狂犬病毒(RABV)和呼吸道肠道病毒(REO)等，这些病毒部分是人畜共患病，病毒检测不合格的血清甚至会影响科研人员的健康与安全。因此我们要选择质控标准严格按照各国药典要求，并遵循FDA颁布执行的cGMP规范生产流程的血清供应商，可在血清生产等各个环节保证产品质量。

6.批间差异小

批间差异小的血清不仅可以保证血清质量，确保细胞培养效果，还能减少由于批间差异带来的使用前测试，且避免实验结果的不可重复性。