LncRNA数据深度挖掘工具——RIP技术

长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是长度大于200个核苷酸的RNA分子，通常不编码蛋白，而是以RNA的形式在表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，成为遗传学研究热点。

图1 LncRNAs作用机制

一般来说，非编码RNA功能研究的主线包含3个主要步骤：

高通量筛选：对收集的样本进行分组，采用高通量测序技术（如RNA-Seq）和相应的特异性数据库进行高通量筛选，通过对转录本编码潜能进行筛选，判断其是否具有编码潜能，从而可以判定该转录本是否为lncRNA。

候选lncRNA的确定：识别不同样品（或样品组）之间显著差异表达的基因或lncRNA，以获取差异表达的候选RNA。在测序得到的非编码RNA中，通常优先选择差异倍数大、表达水平高、且与研究方向相关的。

功能分析与验证：基于生物信息学预测，设计实验来验证非编码RNA的生物学功能。比如通过实时定量PCR、原位杂交等技术，验证RNA在特定样本或条件下的表达情况。还可以通过基因敲除/敲减（如使用siRNA、shRNA或CRISPR/Cas9技术来降低lncRNA的表达水平）或者过表达实验（如通过构建过表达载体提高lncRNA的表达水平）等观察表型变化。要想进行深层次的挖掘，可以研究其作用机制，RNA pull down、RIP、双荧光素酶等实验技术，检测与目标RNA相互作用的蛋白质或RNA，进一步揭示RNA的生物学功能。然后在动物或细胞模型中验证RNA的功能和调控机制，进一步确认其在生理和病理条件下的重要性。

图2 LncRNA研究思路

深入了解LncRNA作用机制能够帮助我们识别疾病的潜在机制，以便寻找新的治疗靶点。特别是在药物研发中，许多药物是通过干扰特定的RNA-蛋白质相互作用来实现其治疗效果的。

RIP和RNA pull-down等实验技术是我们深入研究RNA和蛋白质相互作用的关键工具。RIP运用目标蛋白的特异性抗体分离纯化与蛋白相互作用的RNA，RNA pull-down通过RNA探针捕获与之相互作用蛋白质。今天带大家了解一下RIP技术，具体情况如下：

RIP技术（RNA Binding Protein lmmunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。该技术主要是运用目标蛋白的特异性抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化对结合在复合物上的RNA进行q-PCR验证或高通量测序分析，主要进行已知蛋白与已知RNA互作QPCR验证、已知蛋白与未知RNA互作二代测序筛选等。

图3 RIP技术原理

AG8亚国服务abs50071 RNA免疫共沉淀(RIP)试剂盒提供全流程更详细的使用说明，实验流程清晰明了！试剂盒内自带Normal Rabbit lgG、Normal Mouse lgG两种对照IP抗体，真正的省心kit！！！

图4 abs50071 RNA免疫共沉淀(RIP)试剂盒IP后WB验证图

常见问题：

1、RIP可以分提核浆的RNA-蛋白质复合物吗？

理论上，可以采用能分别抽提核浆蛋白的蛋白抽提kit先分离样本，再进行RIP实验。但是所用kit中的试剂组分不能有RNase和DNase，以及要能与下游的抗体beads孵育兼容。

2、样本中拉下的RNA浓度过低，如何改善？

可能的原因有：样本量过少，考虑增加样本初始量，另一个是裂解不充分，组织样本未研磨充分等原因。

3、溶解曲线异常

出现非特异扩增或有引物二聚体等情况，需重新设计引物。

4、IP和IgG样本Ct值没有什么差异，是什么原因造成的？

可能由于抗体没有富集到RNA，可更换抗体尝试；或者IgG背景过高，可增加洗涤次数或减少免疫沉淀步骤RNA投入量。

5、如何判断RIP实验是否成功？

RIP后WB检测IP组和input组检测到目的蛋白信号即判断RIP实验成功。

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