多能干诱导神经干分化全攻略

在生命的宏伟蓝图中，干细胞扮演着“万能建筑师"的角色，它们具有自我更新和分化成多种类型细胞的能力。而人多能干细胞，作为干细胞家族中比较出色的，更是蕴含着无限可能，能够分化为人体几乎所有的细胞类型，包括神经细胞。这一特性，让科学家们看到了治疗因神经元损失或损伤导致的疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓损伤等）的曙光。然而，要实现这一目标，关键在于找到一种高效、稳定且安全的方法，引导人多能干细胞定向分化为神经干细胞(NSCs)，进而发育成具有特定功能的神经元或胶质细胞。正是基于这一需求，神经诱导培养基应运而生，它如同一座精心设计的桥梁，连接着希望与挑战，带领我们迈向神经再生的新纪元。

下面，小爱给大家分三大块介绍由人多能干细胞的培养方法，人多能干细胞诱导神经干细胞分化方法，人神经干细胞培养方法。

人多能干细胞的培养方法

一、实验准备：

1、人多能干细胞培养基配制

（1）2-8℃解冻hPSC Medium Supplement，融化后上下晃动混匀，按实际用量进行分装，立即使用或储存于-20~-80℃，避免反复冻融；

（2）按1:50的比例将hPSC Medium Supplement(10mL)加入到hPSC Medium Basal Medium(500mL)中，混合均匀即成为人多能干细胞培养基(abs9403)。

注意：混匀后的人多能干细胞培养基可在2-8℃稳定储存2-3周，不建议使用配制已超过3周的人多能干细胞培养基。

（3）实验试剂平衡：人多能干细胞培养基实验前放置室温避光平衡；PBS，消化液等37℃加热。

注意：培养基中含有因子，不要37℃水浴加热。

二、操作方法（以下步骤皆应在无菌条件下操作）

hPSC 细胞复苏：

1、实验操作步骤：

1.1、基质胶包被培养板：取出6孔板/12孔板，每孔内加入1mL/0.5mL即用型基质胶(abs9410)，轻轻晃动6孔板/12孔板使基质胶wan全覆盖皿底，置于37℃培养箱中孵育1h-2h，实验前拿出并置于超净工作台/生物安全柜中室温下平衡20min。如果暂时不用，可用Parafilm封口后2-8℃储存，并于1周内使用。

注意：a.一支冻存的干细胞的数量在1×10⁶cells/mL左右，对应6孔板1孔；

b.即用型基质胶对温度敏感，即用即拿，用完后立即放回4℃冰箱保存，且勿用手直接触碰基质胶液面所及的瓶身，影响基质胶质量。

1.2、先将2-3mL的干细胞培养基加入15mL离心管中备用。

1.3、解冻：将从液氮中取出的冻存管快速浸入37℃温水中，快速摇动，使其在1-2min内快速解冻；

注意：细胞从液氮中拿出的速度要快，尽量减少其暴露在室温中的时间。

1.4、离心：冻存管中的冻存液解冻后，将其逐滴加入含有干细胞培养基的15mL离心管中，将15mL离心管置于低速离心机中配比平衡后，1000rpm离心3min；

1.5、重悬：离心后弃上清加1mL人多能干细胞培养基对干细胞沉淀进行吹吸混匀，吹吸3~5次左右。

1.6、接种：吹吸均匀后，将已经平衡好的即用型基质胶弃掉，将吹打均匀的干细胞悬液加入到已经包被好的6孔板中，并补全每孔2mL培养体系。

1.7、培养：接种后的6孔板可以置于倒置相差显微镜下观察接种的干细胞密度以及细胞团块大小，呈4个细胞以上的团块较合格，水平十字轻轻晃动6孔板/12孔板使细胞均匀分布。并置于37℃，5%CO₂的恒温培养箱培养，第2天观察细胞贴壁情况；

1.8、换液：从复苏的时间开始每24h换液一次。

注意：因培养基中活性成分只足够维持一天，所以每24h应及时更换新鲜培养基。

多能干细胞(PSCs)集落

hPSC 细胞传代：

2、实验具体操作步骤：

2.1、清洗：吸掉原有培养基，贴壁缓慢加入1mL PBS缓冲液并轻轻晃动，然后沿培养皿边缘吸去PBS缓冲液；

2.2、消化：在6孔板中加入2mL/孔人多能干细胞消化液(abs9409)使之覆盖皿底，并置于37℃培养箱中2-5min；

注意：消化时间依据干细胞生长密度，消化时间略有不同，根据经验一般建议时间2-5min。消化过程中可以拿到倒置显微镜下观察细胞消化情况，若在显微镜下观察到大部分克隆边缘以及克隆内部细胞间出现间隙，即可吸掉消化液终止消化。

2.3、吹打：吸掉消化液后，加入2mL人多能干细胞培养基，用移液枪扇形吹打培养皿底，轻柔吹打3-5次，使皿底干细胞集落脱落，并将其并转移到15mL离心管中；

注意：吹吸皿底细胞的力度要轻柔，吹打脱落和吹吸混匀的次数在3-5次为宜，尽量避免形成单细胞。如有少量细胞无法从皿底脱落，属于正常现象。如有大量细胞无法从皿底脱落，需延长消化时间。

2.4、离心：1000rpm离心3min，弃上清；

2.5、接种：用干细胞培养基吹打细胞5-10次，吸掉包被培养板中的基质胶，并将细胞悬液加入到培养板中，且补全每孔2mL的培养体系。

注意：吹打细胞要温柔，并且吹打次数不要超过10次。

2.6、换液：从传代的时间开始每24h换液一次。

注意：因培养基中活性成分只足够维持一天，所以每24h应及时更换新鲜培养基。

多能干细胞(PSCs)集落染色图

hPSC 细胞冻存：

3、实验具体操作步骤：

3.1、清洗：同2.1；

3.2、消化：同2.2；

3.3、吹打：同2.3；

3.4、离心：同2.4；

3.5、重悬：离心后弃上清，加入2mL ES/iPS细胞冻存液(abs9412)对干细胞沉淀进行吹吸混匀，吹吸3-5次后，将其加入到冻存管中；

注意：冻存液即用即拿，及时放回 4℃冰箱。

3.6、记录：在冻存管上标记冻存细胞种类、时间、操作者及细胞批次。

3.7、-80℃冰箱冻存：冻存管置于-80℃冰箱过夜。

注意：冻存管放置于-80℃冰箱时，要将冻存管直立放置，切忌冻存管斜放或横放。

3.8、液氮冻存：24h后将-80℃冰箱中的细胞转移至液氮中长期冻存。

人多能干细胞诱导神经干细胞分化方法

诱导培养基准备 

1、将冷冻的PSC补充液在2°C至8°C下解冻过夜，或在37°C水浴中快速解冻约5min；

2、解冻后的补充液可分装成多个相同的等份，并在-5°C至-20°C保存，以制备较小体积的完整培养基。不要重新冷冻解冻；

3、将小瓶轻轻倒置几次，混合解冻后的补充液；

4、从瓶中取出20mL PSC补充液，转移到PSC培养基瓶中。旋转瓶子混合，即得500mL人多功能干细胞(PSC)诱导神经干培养基(abs9822)，简称诱导培养基；

5、诱导培养基可在2°C至8°C保存2周。使用前，在37°C水浴中预热当天所需量的完整培养基5-10min。

PSC细胞准备 

1、按照人多能干细胞的培养方法—hPSC细胞复苏步骤—1.1-1.8复苏PSCs；

2、当PSCs达到70-80%的融合度时，去除任何分化和部分分化的克隆；

3、对PSCs进行传代操作，按照人多能干细胞的培养方法—hPSC细胞传代步骤—2.1-2.4传代；

4、从新包被的6孔板中吸除包被液，并在每孔中加入2.5mL诱导培养基；

5、轻轻摇动含有诱导细胞悬液的离心管，将PSC以每孔2.5×10⁵ - 3×10⁵的细胞加入包被的6孔板中。例如，如果PSC悬液中的细胞团浓度为1×10⁶个/mL，则在每孔中加入0.25-0.3mL的诱导培养基；

6、快速前后左右移动培养皿，使细胞分散在培养皿表面，并将其轻轻置于37°C、5% CO₂的培养箱中；

注意：a.传代PSCs时，细胞应以小团块的形式接种，而不是单个细胞悬液。避免将PSCs作为单个细胞进行接种，因为这会导致细胞死亡增加；

b.您可以在分裂时将10μM ROCK抑制剂Y27632加入PSC培养基中过夜，以防止细胞死亡。

神经诱导

1、预热诱导培养基至室温；

2、在神经诱导的第0天（PSC传代后约24h），PSC应达到15-25%的融合度。抽吸废培养基，在6孔板的每孔中加入2.5mL预热好的诱导培养基。将培养皿放入37°C、5% CO₂的培养箱中；

3、在神经诱导的第2天，细胞集落的形态应该是一致的。标记所有非神经分化克隆，如果有的话，用巴斯德玻璃移液管或移液管jian端去除这些不需要的克隆。抽吸废培养基，在6孔板的每孔中加入2.5 mL预热好的诱导培养基。将培养皿放回培养箱；

4、在神经诱导的第4天，细胞将达到融合。任何非神经分化的克隆都应标记并移除。从每孔中抽吸废培养基，每孔用5mL预热的诱导培养基代替，将培养皿放回培养箱；

5、在神经诱导的第6天，细胞应接近最大融合。去除任何非神经分化克隆，在每个孔中加入5mL预热的诱导培养基。将培养皿放回培养箱；

注意：在神经诱导的第4-7天，如果细胞的颜色变为褐色， 并且有许多漂浮细胞，说明PSCs的起始密度过高。在这种情况下，每天更换培养基，每孔加5mL诱导培养基。

6、在神经诱导的第7天，NSCs(P0)已经准备好收获和扩增传代。

人神经干细胞培养方法

准备神经干细胞(NSC)扩增wan全培养基

1、NSC wan全培养基需要补充NSC补充剂、L-丙氨酰-谷氨酰胺；

2、在无菌环境中，依次将20mL NSC补充剂和5mL 200mML-丙氨酰-谷氨酰胺(abs9295)（2mM终浓度）加入到含有480mL NSC培养基中，此时即得神经干细胞(NSC)扩增wan全培养基(abs9821)；

3、（可选）在培养基中加入10mL/L的抗生素（青霉素-链霉素）溶液。

注意：a.在所有成分的有效期限内，在2°C至8°C的黑暗环境中储存，可稳定长达4周；

b.可选择添加200μM抗坏血酸，特别是悬浮培养。

包被孔板

1、基质胶包被培养板：取出6孔板/12孔板，每孔内加入1mL/0.5mL即用型基质胶(abs9410)，轻轻晃动6孔板/12孔板使基质胶wan全覆盖皿底，置于37℃培养箱中孵育1h-2h，实验前拿出并置于超净工作台/生物安全柜中室温下平衡20min。如果暂时不用，可用Parafilm封口后2-8℃储存，并于1周内使用；

2、在使用前，将已经平衡好的即用型基质胶弃掉，然后加入预热的wan全NSC培养基。

NSC传代

1、当细胞密度达到90-100%的融合度时，丢弃培养瓶中的培养基；

2、用5mL不含钙和镁的预温DPBS洗涤细胞，然后吸弃溶液；

3、在每个培养瓶中加入1.0mL预热的人多能干细胞消化液(abs9409)，然后在室温下孵育2-5min。在孵育前确保wan全覆盖细胞；

4、用倒置显微镜观察细胞是否脱离。如有必要，轻拍培养瓶以促进细胞脱离；

5、轻轻上下移液，使团块分散到单个细胞悬液中；

6、加入9mL预热好的NSC wan全培养基停止细胞解离反应，然后将细胞悬液转移到无菌离心管中；

7、200×g离心4min；

8、丢弃上清，然后用适量NSC wan全培养基重悬细胞沉淀；

9、用自动细胞计数器测定总活细胞密度；

10、从每个覆盖层培养瓶中除去覆盖层溶液，然后加入5mL预热的NSC wan全培养基，添加Y27632（终浓度10μM）；

11、在每个培养瓶中加入5×10⁴细胞/cm²（例如，1.25×10⁶细胞/T-25培养瓶），然后混合或旋转细胞悬液以确保均匀分布；

12、于37°C，5%CO₂的潮湿环境中孵育。

注意：为了获得最佳性能和细胞生长，每2-3天更换一次培养基，用新鲜的预热的NSC wan全培养基。

NSC冻存

1、准备干细胞冻存液(abs9412)；

2、按照“NSC传代"中的步骤1至步骤7收集细胞进行冷冻保存；

3、在离心过程中，计算细胞密度为2×10⁶个活细胞/mL所需的最终体积；

注意：接下来的步骤需要半体积的室温NSC培养基和半体积的冻存液。

4、丢弃上清，然后用NSC wan全培养基重悬细胞；

5、加入等量的冻存液，使终浓度为10%DMSO；

6、立即将细胞悬液等分放入冻存瓶中（1mL/瓶）；

7、按照标准程序（每分钟降低1°C）在自动或手动控制速率的冷冻设备中实现低温保存；

8、将冷冻细胞转移到液氮中。

NSC复苏

1、在37°C水浴中迅速(<2min)解冻细胞；

2、用移液管将冻存液全部移入无菌的15mL离心管中；

3、小心滴加（每秒1滴），加入4mL预热好NSC wan全培养基，然后轻轻旋转离心管混合；

4、继续添加预热的NSC wan全培养基至10mL；

5、200×g离心4min，确认细胞沉淀，丢弃上清；

6、加入5mL预热好NSC wan全培养基重悬细胞沉淀，然后添加Y27632（终浓度10μM），再将离心管的全部内容物转移到包被的组织培养瓶中；

7、于37°C，5%CO₂的潮湿环境中孵育；

8、复苏后24h用新鲜的预热过的NSC wan全培养基替换培养基。

注意：为了恢复在NSC中生长的细胞，我们建议在初始传代时以≥1×10⁵个细胞/cm²的密度接种细胞。

今天讲解就到这了，大家如有细胞培养问题，欢迎一起交流哦！

本期小爱推荐

Absin产品线：

爆款产品：试剂盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化检测、残留检测、多因子检测)；细胞培养(类器官试剂盒+基质胶，胎牛血清+培养添加剂+细胞因子)、分化试剂盒；分子(mRNA合成服务+提取试剂盒)；化合物大包装；辅助试剂、耗材/仪器、定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...

特色产品：鸡胚提取物CEE、B27、N2、霍乱毒素B亚单位CTB、牛脑垂体提取物BPE、百日咳毒素PTX、重组人胰岛素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...