LncRNA数据深度挖掘工具（二）

RIP(RNA Immunoprecipitation)和RNA pull-down等实验技术是我们深入研究RNA和蛋白质相互作用的关键工具。RIP运用目标蛋白的特异性抗体分离纯化与蛋白相互作用的RNA，RNA pull-down通过RNA探针捕获与之相互作用蛋白质。上文我们详细了解了RIP技术，今天带大家了解一下RNA pull-down技术。

RNA pull-down

RNA pull-down是研究细胞内RNA与蛋白/RNA结合情况的技术。先将RNA进行标记（如生物素标记），再与细胞裂解液共同孵育，从而形成RNA-RNA/蛋白质复合物，进而检测与之结合的RNA或蛋白质。复合物洗脱后，通过荧光定量PCR(RNA pull down-QPCR)或高通量测序(RNA pull down-seq)方法来鉴定目标RNN是否与某些RNA分子相互作用，通过Western blot(pull down-WB)实验和质谱(pull down­-MS)技术检测目标RNA是否与某些蛋白相互作用。

RNA Pull down技术原理

RNA pull down实验的大致流程：

1、探针制备

设计并合成含有T7启动子的特异性引物。

使用含有目的基因的质粒作为模板进行PCR扩增。

利用PCR产物作为模板进行体外转录，获得目的RNA。

对目的RNA进行标记，通常使用生物素标记。

2、细胞裂解液准备

收集细胞并裂解，制备细胞裂解液。

通过离心去除细胞碎片，收集上清液。

3、RNA-蛋白质复合物形成

将标记的RNA探针与细胞裂解液混合，在适宜条件下孵育，使得RNA与潜在的蛋白质结合并形成复合物。

4、磁珠结合与洗涤

加入链霉亲和素磁珠，这些磁珠能够与生物素标记的RNA结合。

颠倒混匀，使磁珠与RNA-蛋白质复合物充分接触并结合。

通过磁场分离磁珠，去除未结合的物质。

多次洗涤磁珠，以去除非特异性结合的蛋白质。

5、富集蛋白的洗脱

使用适当的洗脱缓冲液洗脱与RNA结合的蛋白质。

6、蛋白质检测与鉴定

SDS-PAGE电泳和银染色以初步检测富集到的蛋白质。

质谱分析或Western blotting等技术进一步鉴定所富集的蛋白质。

7、数据分析

分析质谱数据以确定与RNA相互作用的蛋白质种类。

对鉴定到的蛋白质进行功能注释和网络分析，以理解RNA-蛋白质相互作用的生物学意义。

RNA pull down实验流程

RNA pull down常见问题

1、实验全程需要注意什么？

实验使用的所有试剂耗材需经过去RNA酶处理，样本也需要加⼊蛋白酶和RNA酶抑制剂，最好能够进行超声处理。裂解蛋白的全程尽量在冰上操作。

2、除了体外转录，还有别的方式获取目的RNA吗？

体外转录相比化学合成纯度更高，pull-down实验⼀般是体外转录得到目的RNA。但是当目的RNA序列大于2000bp时体外转录就不太容易转录成功，这种情况下，我们可以设计合成⼀小段目的RNA探针，通过探针与目的RNA结合，再与蛋白结合。

3、RNA体外转录浓度达到多少才能用，其OD⼀般都不高，可以使用吗？如何定量呢？

通过体外转录得到的RNA浓度都能达到2μg/uL以上，OD值不高可进行RNA纯化，即便不纯化在实验中多加⼀些RNA亦可。定量⼀般会进行琼脂糖凝胶电泳检测，可以根据marker浓度来判断RNA的浓度。也可以用仪器测量RNA的浓度。并且pull-down实验不需要特别精确的定量，一般都会加入过量的探针。 

4、lncRNA引物设计与普通的引物设计有什么区别？

体外转录扩增的引物只需要在正向引物5’端加⼊T7启动子序列即可。 

5、做lncRNApull down+质谱⼀般都会发现多个互作蛋白对吗？如何选择哪一种蛋白继续研究下去？

不同的RNA结合蛋白的数量不等，不能一概而论，根据自己研究的方向或相关功能确定筛选蛋白。

凝胶迁移或电泳迁移率(EMSA)

除RIP和RNA pull Down以外，凝胶迁移或电泳迁移率检测(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)，也称为凝胶阻滞实验或DNA结合实验，是一种广泛应用于分子生物学的研究技术，也可以用于研究蛋白质（尤其是转录因子）与DNA或RNA之间的相互作用。

基本原理

EMSA的基本原理是利用凝胶电泳技术来观察蛋白质与DNA或RNA形成复合物后迁移速率的变化。当蛋白质与标记的DNA或RNA片段结合后，形成的复合物比未结合的探针分子更大，因此在电泳过程中迁移速度较慢。通过比较样品中自由探针与结合探针的比例，可以推断出蛋白质与核酸的结合情况。

EMSA基本原理

实验步骤

准备样本：提取细胞内的蛋白质或核蛋白。

标记探针：使用放射性或非放射性标记技术标记特定的DNA或RNA序列。

蛋白质-核酸结合：将标记的探针与待测蛋白质混合，允许它们结合。

凝胶电泳：将混合物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

检测：通过放射自显影或其他检测方法（如化学发光）来观察条带。

EMSA相关FAQ

1、三种实验技术如何选择？

EMSA主要用于研究RNA与蛋白质之间的直接结合情况，比较倾向于定性分析，通常针对已知RNA研究相应蛋白，适用于初步筛选。

RIP更适合研究体内条件下特定RNA结合蛋白与RNA的相互作用。

RNA pull-down是一种直接鉴定与特定RNA结合的蛋白质的有效方法，适用于体外研究。

选择哪种方法取决于您的研究目标和可用资源。例如，如果您想鉴定特定RNA结合蛋白与哪些RNA分子相互作用，那么RIP可能是更好的选择；如果您想研究特定RNA序列与哪些蛋白质相互作用，RNA pull-down可能是更合适的选择。

2、为什么看不到迁移带？

样本中的蛋白质含量不足；标记的探针浓度过低；标记效率低；蛋白质失活，确保蛋白质在处理过程中没有变性或失活，避免反复冻融，使用新鲜制备的蛋白质样品。曝光或检测时间不足；复合物不稳定等因素。

3、实验背景高是为什么？

蛋白的质量不高，杂质多；曝光或者成像时间过长；封闭时间不足洗涤效果不佳；实验过程中膜没有一直处于湿润状态；标记探针的浓度过高等因素。

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