如何评估类器官免疫共培养杀伤效果

概述

类器官免疫共培养是一种先进的研究手段，它结合了3D的类器官培养技术和免疫细胞，以模拟体内微环境并研究细胞间的相互作用。这种共培养策略已被广泛应用于疾病建模、药物筛选、个性化治疗、炎症机制研究、肿瘤免疫相互作用研究以及上皮-免疫细胞相互作用的研究。那么，如何评估类器官免疫共培养杀伤效果？小爱从免疫共培养方法和杀伤效果检测方法两方面给大家介绍一下。

免疫共培养方法

一、PBMC制备

1、实验前准备

试剂提前1h准备：人淋巴细胞分离液(abs930)提前1h取出，在室温充分平衡并颠倒混匀。

2、外周血梯度密度离心步骤

（1）采集人的外周血样本于抗凝管中，室温保存，血液样品离体建议2h内处理效果更好，若无法及时处理，4°C保存，12h内处理；

（2）取15mL离心管，加入2mL血液，再加入2-4倍PBS(abs962)稀释外周血，吹打混匀；

▲注意：血液样本越稀释，单核细胞的纯度越好。

（3）取新的15mL离心管中，加入5mL淋巴细胞分离液，将试管稍微倾斜将4mL稀释的外周血悬液沿着管壁缓慢的加入离心管；

▲注意：人淋巴细胞分离液在使用前需室温充分平衡并颠倒混匀，分离时温度以18-25℃为宜，不要破坏淋巴细胞分离液和细胞悬液的分界面。

（4）20℃，400g离心30min。

▲注意：离心结束速度要设置升速(ACC)1，降速(DEC)1，不能骤停。

（5）离心后取出试管，可以看到不同的分层（如下图1），去除上层血浆层，小心地吸取白膜层(PBMC)到新的离心管中；

（6）加入3倍体积的PBS，和白膜层充分混匀，18-20℃下以350g离心10-15min。小心弃去上清液；

（7）重复步骤6-次，进行后续共培养。

图1 离心后血液分层

二、类器官的收集

1、类器官收集及洗涤

（1）收集：移液器吸去培养基，每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶，收集在15mL离心管中（24孔板，每5孔为一组）；

图2 分离类器官

（2）洗涤：加类器官传代培养缓冲液G定容至14mL（缓冲液越多，基质胶被稀释的越充分，越容易去除），4℃静置40min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化，如果冰箱保温效果强，缩短冷冻时间，摸索合适的冷冻时间时，可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了）；

（3）接下来将离心管进行300g，4℃，离心5min，离心完通常会有这两种情况：

第一种是正常情况，分成三层（如下图），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。

图3 分层现象

第二种是不正常情况，分成两层（如下图），这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液，留下基质胶类器官混悬液，重复上一步洗涤步骤，再次冷化离心，通常能出现清晰分层（缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。如果依然是两层（缓冲液层和基质胶类器官混悬液层），此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶类器官混悬液，保留下2/3即可。

图4 分层现象

促进基质胶和类器官有效分离条件：

a. 离心机的选择非常重要，水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离；

b. 离心机的温度最好是4℃（可避免基质胶固化），离心转速可适当提高（最高不要超过500g），离心时间可适当加长（最常不超过10min）。

三、共培养

1、试剂准备

T细胞无血清wan全培养基：免疫细胞无血清培养基(abs9772)+200-500U/mL IL-2(abs04045)+3ug/mL CD3/CD28磁珠(abs160019)；

类器官无血清培养基：提前放于4℃融化；

96孔超低吸附培养板(abs7059)

▲注意：使用无血清体系和超低吸附板均可有效避免类器官贴壁。

2、共培养步骤

（1）使用T细胞无血清wan全培养基重悬PBMC，96孔板，5*10^5个PBMC/每孔，100uL细胞悬液/每孔；

（2）使用类器官无血清培养基重悬类器官，向含T细胞的96孔板中加入250-333个类器官/每孔，100uL类器官悬液/每孔，总体积200uL，进行共培养。（24孔板，3-4万T细胞，类器官20个；96孔板，0.5-1万T细胞，类器官5-6个）

杀伤检测方法

检测T细胞对肿瘤类器官杀伤效果有多种检测指标，比如T细胞靶向识别杀伤、免疫浸润检测、类器官毒性LDH检测、上清细胞因子检测、类器官活死染色。接下来，小爱给大家详细聊一下每种检测指标。

一、T细胞靶向识别杀伤

使用CD31抗体偶联FITC来标记T细胞，可以帮助研究者追踪和分析T细胞的行为，例如它们的迁移、分布和与类器官的相互作用。在上述免疫共培养方法的一、PBMC制备后，进行T细胞标记。

1、细胞计数和调整浓度：

计数T细胞，并根据实验需要调整细胞浓度，通常在实验前将细胞浓度调整到适当的工作浓度。

2、抗体与细胞的孵育：

将FITC标记的CD31抗体(abs1840383)按照说明书推荐的浓度与T细胞悬液混合，并在适当条件下孵育一段时间，使抗体与T细胞表面的CD31抗原充分结合。

3、洗涤：

孵育后，使用适当的缓冲液（如PBS）洗涤T细胞，以去除未结合的抗体。

4、然后紧接着做免疫共培养方法的二、类器官的收集和三、共培养；

5、使用高内涵录像及拍照，可以实时检测T细胞对类器官的识别及趋向运动，如下图片及视频： 

图5 杀伤效果明肠图

此图为我司做得免疫共培养实验，从上图可明显看出B药物作用下，T细胞有明显的杀伤效果。

视频1 单独类器官对照

视频2 单独T细胞对照

视频3 T细胞和类器官共培养

图解：相比于视频1和视频2，对T细胞进行CD31抗体偶联FITC标记后，会看到T细胞不断趋向类器官，并在类器官周围聚集，靶向识别杀伤类器官，最终类器官出现发黑、崩解、坏死。

二、免疫浸润检测

1、将共培养后的类器官和悬浮的T细胞分离：小心用枪头将上清吸弃，留下类器官；加入适量类器官传代缓冲液(abs9730)，吹打重悬类器官，待自然沉降后，吸弃掉上清，可以根据实际情况选择清洗次数；

2、类器官的石蜡切片免疫组化，可以参考链接类器官HE染色、免疫组化、免疫荧光鉴定方法，T细胞检测marker根据实验需求来，比如CD31。

三、类器官毒性LDH检测

1、实验准备

（1）Lactate Dehydrogenase Microplate Assay Kit (abs580007)

注意：

底物：使用前加入1mL蒸馏水溶解，-20℃保存；

染料试剂A：使用前加入9mL蒸馏水溶解，混合，4℃保存；

标准：使用前加1mL蒸馏水溶解；然后加入0.3mL到0.7mL；

蒸馏水：浓度为600μmol/L；

阳性对照：使用前加入0.1mL蒸馏水溶解。

（2）酶标板读取器读取吸光度在450nm

（3）蒸馏水

（4）移液器，多通道移液器

（5）冰

（6）离心机

（7）计时器

2、样本准备

将共培养后的上清液转移到试剂盒自带的96孔微孔板。

3、实验步骤

在微孔板中加入以下试剂：

注意：

（1）将上面的标准品连续稀释2倍，制作标准曲线；

（2）对于未知的样品，我们建议做一个预实验和测试几个剂量确保读数在标准曲线范围内。如果酶活性较低，请在反应体系中加入更多的样品，或者增加反应时间；如果酶活性较高，请稀释样品，或减少反应时间。

4、计算

单位定义：一个单位的LDH活性被定义为酶每分钟产生1nmol NADH。

根据上清体积

LDH (U/mL) = (C_Standard × V_Standard) × (OD_Sample - OD_Control) / (OD_Standard - OD_Blank)/V_Sample/T

= 1200 × (OD_Sample - OD_Control) / (OD_Standard - OD_Blank)

C_Standard：标准品浓度，600μmol/L = 600 nmol/mL；

V_Sample：样品体积，0.01mL；

V_Standard：标准品体积，0.1mL；

T: 反应时间，5minutes

5、典型数据

标准曲线仅供演示。每次测定必须重新测定标准曲线。

图6 标准曲线

检测范围：30μmol/L-600μmol/L

图7 96孔板阳性对照反应柱状图

四、上清细胞因子检测

类器官免疫共培养用于评估细胞杀伤效果时，可以通过检测上清液中的细胞因子来反映免疫细胞的活性和对类器官的影响。以下是一些常见的细胞因子，它们在评估免疫细胞杀伤效果时可能被检测：

干扰素-γ(IFN-γ)：通常由活化的T细胞和NK细胞产生，与细胞毒性和免疫调节有关；

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)：由多种免疫细胞产生，参与细胞死亡和炎症反应；

白细胞介素-2(IL-2)：主要由活化的T细胞产生，促进T细胞增殖和活化；

白细胞介素-4(IL-4)：主要由Th2细胞产生，参与体液免疫反应和抗炎作用；

白细胞介素-6(IL-6)：一种多功能细胞因子，参与免疫应答和炎症反应；

白细胞介素-10(IL-10)：具有抗炎作用，由多种细胞类型产生，包括调节性T细胞；

白细胞介素-12(IL-12)：促进Th1细胞分化和IFN-γ的产生；

白细胞介素-17(IL-17)：主要由Th17细胞产生，与炎症和自身免疫疾病有关；

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)：促进粒细胞和巨噬细胞的增殖和活化；

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)：促进中性粒细胞的增殖和活化；

趋化因子：如CXCL8(IL-8)、CCL2(MCP-1)等，参与免疫细胞的迁移和定位；

穿孔素(Perforin)：由细胞毒性T细胞和NK细胞释放，用于杀死靶细胞；

颗粒酶(Granzymes)：与穿孔素一起由细胞毒性T细胞和NK细胞释放，引起细胞凋亡；

调节性T细胞相关细胞因子：如TGF-β，由调节性T细胞产生，具有免疫抑制作用；

生长因子：如血管内皮生长因子(VEGF)，可能与肿瘤血管生成和免疫逃逸有关。

检测这些细胞因子可以通过多种方法进行，包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、多因子检测试剂盒、细胞因子芯片、流式细胞术等。选择哪种检测方法取决于实验设计、所需灵敏度和特异性、以及实验预算。通过分析这些细胞因子的水平，可以评估免疫细胞对类器官的杀伤效果和免疫反应的总体情况。

以最常测的IFN-γ为例，采用ELISA方法举例：

1、实验准备

（1）Human IFN-γ ELISA Kit(abs510007-96T)

（2）酶标仪（可测量450nm检测波长的吸收值及540nm或570nm校正波长的吸收值）

（3）高精度加液器及一次性吸头

（4）蒸馏水或去离子水

（5）洗瓶（喷瓶）、多通道洗板器或自动洗板机

（6）500mL量筒

2、样品准备

培养上清：颗粒物应通过离心去除；立刻检测样本。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂(1×)稀释。

3、试剂配制（使用前请将所有试剂和样本放置于室温，静置15min。建议所有的实验样本和标准品做复孔检测）

①1×洗涤液配制：试剂盒中的浓缩洗涤液为20×母液，使用前需使用蒸馏水稀释为1×工作液。取10mL浓缩洗。例：涤液+190mL蒸馏水定容至200mL，实际操作时可先计算使用量，再进行配制。

②1×稀释用缓冲液配制：试剂盒中的浓缩稀释用缓冲液为10×母液，使用前需使用蒸馏水稀释至1×工作液。例：取3mL浓缩稀释用缓冲液+27mL蒸馏水定容至30mL。实际操作时可先依据样本稀释倍数，计算所需的稀释用缓冲液用量，再进行配制。

③检测抗体：将干粉离心至管底，使用110uL稀释用缓冲液(1×)溶解，室温静置5min后得到100×母液；使用前需稀释为1×工作液。按照每孔用量100uL计算所需体积。 使用了10个孔，则取10uL的100倍工作浓度的检测抗体。例：使用稀释用缓冲液(1×)定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。

④SA-HRP：SA-HRP为40×母液，使用前需使用稀释缓冲液(1×)稀释配制成1×工作液，每孔所需量为100uL。例： 使用了10个孔，则取25uL的40×母液+975uL稀释用缓冲液(1×)定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。

⑤显色剂：按每孔100uL，计算当次试验所需要用量，取出相应体积的显色剂，避光；取出的显色剂仅供当日使用。

⑥标准品：冻干标准品用稀释用缓冲液(1×)重溶，重溶体积1000uL，得到浓度为600pg/mL标准品母液。轻轻震摇至少5min，其充分溶解。每个稀释管中加入300uL稀释用缓冲液(1×)。将标准品母液参照下图做系列稀释，每管须充分混匀后再移液到下一管。没有稀释的标准品母液可用作标准曲线最高点(600pg/mL)，稀释用缓冲液(1×)可用作标准曲线零点(0pg/mL)。

图8 标准品稀释比例示意图

二、操作步骤

1、准备好所有需要的试剂和标准品；

2、从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，未用的板条请放回铝箔袋内，重新封口；

3、向微孔板中加入300uL洗涤液，静置浸泡30s，弃掉洗液在吸水纸上将微孔板拍干，请立即使用不要让微孔板干燥；

4、分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔100uL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2h;

5、将板内液体吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自动洗板机洗板。每孔加洗涤液300uL，然后将板内洗涤液吸去。 重复操作3次。每次洗板尽量吸去残留液体会有助于得到好的实验结果。最后一次洗板结束，请将板内所有液体吸干或将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；

6、在每个微孔内加入100uL检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2h；

7、重复第5步洗板操作；

8、在每个微孔内加入100uLSA-HRP，室温孵育20min。注意避光；

9、重复第5步洗板操作；

10、在每个微孔内加入100uL显色液，室温孵育5-30min，注意避光；

11、在每个微孔内加入50uL终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；

12、加入终止液后30min内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm或570nm作为校正波长。如果没有使用双波长校正，结果准确度可能会受影响；

13、计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。若样本经过稀释，计算浓度时应乘以稀释倍数。

图9 标准曲线

注： 提供的标准曲线数据仅供参考，应根据同次试验所绘标准曲线计算样本含量。

五、类器官活死染色

类器官活死染色是一种用于评估类器官中活细胞与死细胞比例的实验技术，对于研究类器官的增殖状态和细胞凋亡具有重要意义。Calcein-AM是一种常用的活细胞荧光标记染料，能够发出绿色荧光，而碘化丙啶(PI)则用于标记死细胞，发出红色荧光。通过荧光显微镜观察，可以清晰地区分活细胞和死细胞。

1、将共培养后的类器官和悬浮的T细胞分离：小心用枪头将上清吸弃，留下类器官；加入适量类器官传代缓冲液(abs9730)，吹打重悬类器官，待自然沉降后，吸弃掉上清，可以根据实际情况选择清洗次数；

2、可以参考链接类器官原位活死染色实验攻略进行活死染色。

今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎公众号后台交流哦！

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