染色质免疫沉淀法(ChIP)手册（一）

1、什么是CHIP、CHIP研究什么？

CHIP全称染色质免疫沉淀法，是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的实验技术。它可以用来检测特定的蛋白质-DNA相互作用，如组蛋白、转录因子等与基因组特定区域的结合情况。ChIP技术可以帮助研究者了解细胞或组织中的基因表达和调控机制。

图1 组蛋白八聚体

* 名词解释

组蛋白：真核生物细胞核中的一种碱性蛋白质，它们的主要功能是帮助DNA分子的压缩和组织，使其能够适应细胞核内有限的空间。组蛋白与DNA一起构成了染色体的基本结构单元，称为核小体。

转录因子：是一类蛋白质，它们可以结合到DNA分子上的特定序列，从而调控基因的转录过程。转录因子在细胞中扮演着至关重要的角色，它们控制着基因表达的时间、地点和程度，从而影响细胞的功能和生物体的发育。

转录辅因子：是一类在增强子与启动子之间传递调控信息的蛋白质，它们是转录激活和基因表达的核心效应分子。转录辅因子通过与特定的转录因子相互作用，增强或抑制基因的转录。它们可以对不同类型的核心启动子表现出特异性，这意味着不同的转录辅因子可能对不同的启动子类型有偏好性，从而影响基因表达的特异性和多样性。

2、ChIP能做什么，使用场景有哪些？

确定特定蛋白质在基因组中的结合位点：通过使用针对特定蛋白质的抗体，可以将这些蛋白质及其结合的DNA片段从细胞中沉淀下来，然后通过测序或PCR分析这些DNA片段，从而确定蛋白质的DNA结合位点。

研究蛋白质-DNA相互作用的动态变化：可以在不同的时间点或不同的生理条件下进行ChIP实验，以研究蛋白质与DNA相互作用的变化，例如在细胞分化、发育或响应环境信号时。

分析组蛋白修饰：ChIP实验可以用来研究特定组蛋白修饰在基因组中的分布，这些修饰与基因的激活或沉默有关。

研究转录因子的DNA结合特性：通过ChIP实验，可以确定转录因子在基因启动子区域或增强子区域的结合情况，从而揭示其调控基因表达的机制。

全基因组分析：结合下一代测序技术(ChIP-seq)，ChIP实验可以用于全基因组范围内的蛋白质-DNA相互作用分析，提供高分辨率的基因组结合图谱。

使用场景举例：

如果您对一种特定的转录因子如何在不同发育阶段调控基因表达感兴趣。你可以在胚胎发育的不同阶段进行ChIP实验，使用针对该转录因子的抗体来沉淀与其结合的DNA片段。通过测序这些DNA片段，你可以确定该转录因子在基因组中的结合位点，并分析这些位点在不同发育阶段的变化。这些数据可以帮助你理解该转录因子如何调控特定基因的表达，从而影响胚胎的发育过程。

另一个例子是研究组蛋白修饰。如果你想了解在细胞应激反应中，组蛋白H3的乙酰化修饰是如何变化的，你可以在应激前后进行ChIP实验，使用针对乙酰化H3的抗体。通过比较应激前后的ChIP结果，你可以揭示应激如何影响组蛋白修饰模式，进而调控基因表达和细胞功能。

3、ChIP有哪些类型？

根据是否使用交联剂，可以分为天然ChIP(N-ChIP)和交联ChIP(X-ChIP)。

标准ChIP(X-ChIP)：在这种实验中，使用交联剂（如甲醛）来固定细胞，这样可以将蛋白质与DNA之间的相互作用固定下来。交联是必要的步骤，因为它可以稳定蛋白质与DNA之间的暂时性或弱相互作用，使得在后续的染色质制备和免疫沉淀过程中这些相互作用不会解离。适用于研究那些与DNA结合不是非常稳定的蛋白质，如转录因子。

天然ChIP(N-ChIP)：在这种实验中，不使用交联剂。这种方法通常用于研究那些与DNA结合非常稳定的蛋白质，如某些组蛋白修饰，它们的结合足够稳定，以至于不需要额外的交联就能在实验过程中保持与DNA的结合。

4、ChIP 实验中磁珠法和琼脂糖珠法有什么不同？

操作便利性：使用磁珠可以快速分离蛋白质-DNA复合物，不需要离心，操作简便，样品不容易丢失，洗得更che底。传统的方法是使用琼脂糖珠，价格便宜，但需要离心，耗时长，且在离心过程中珠子可能破裂。

特异性：磁珠法通常具有较高的特异性，因为磁珠表面可以更均匀地结合抗体，减少了非特异性结合。琼脂糖珠法需要额外的预清除步骤来减少这种非特异性结合。

成本：磁珠法虽然操作简便，但磁珠的成本通常高于琼脂糖珠。琼脂糖珠法成本较低，适合预算有限的实验室。

应用范围：磁珠法适用于高通量测序，如ChIP-Seq，因为磁珠不会在测序过程中产生干扰。

琼脂糖珠法：适用于传统的ChIP实验，但在高通量测序中可能会受到限制。

*为什么琼脂糖珠法会影响测序？

琼脂糖珠与DNA的结合：在ChIP实验中，目标是沉淀与特定蛋白质（如组蛋白修饰或转录因子）结合的DNA。琼脂糖珠表面通常通过共价键结合有蛋白质A或蛋白质G，这些蛋白质能够与抗体的Fc段结合。当抗体与蛋白质结合后，与之相连的DNA也应该被捕获。然而，琼脂糖珠本身也可能非特异性地结合DNA，这种结合可能会在珠子表面形成一层DNA包裹，从而阻碍DNA的洗脱和后续的分析。

物理屏障：被琼脂糖珠非特异性结合的DNA可能形成一种物理屏障，阻止洗脱缓冲液中的化学成分接触到所有被捕获的DNA，或者阻碍测序平台的酶和试剂接触到目标DNA。这种物理屏障会影响DNA的洗脱效率和测序的覆盖度。

洗脱效率：在ChIP实验的最后阶段，需要将沉淀的DNA从琼脂糖珠上洗脱下来以便进行后续的分析，如PCR、qPCR或测序。如果DNA被封闭，洗脱效率会降低，导致洗脱下来的DNA量减少，这会影响后续实验的灵敏度和准确性。

测序覆盖度：由于DNA封闭现象，一些DNA片段可能无法被有效地洗脱和扩增，导致测序时这些区域的覆盖度不足。这可能会导致对DNA-蛋白质相互作用的分析产生偏差，因为某些区域可能被错误地认为是没有相互作用发生的。

测序准确性：DNA封闭还可能导致测序数据的准确性下降。由于封闭的DNA片段可能无法被测序平台准确读取，这可能会导致数据中的假阴性结果。

5、ChIP是如何工作的？

图2 chip实验流程

以交联ChIP即X-ChIP为例，实验的工作原理可以概括为以下几个步骤：

交联：细胞或组织首先被甲醛或其他交联剂处理，这一步使得蛋白质与DNA之间的相互作用以及蛋白质之间的相互作用被固定下来，防止在后续步骤中解离。

细胞裂解和染色质剪切：交联后的细胞被裂解，释放出染色质。

染色质随后被剪切成较小的片段，这可以通过超声波处理(sonication)或酶消化（如使用微球菌核酸酶MNase）来实现。这一步是为了让目标DNA片段变短，便于后续的沉淀和分析。

免疫沉淀：使用针对特定蛋白质的抗体进行免疫沉淀。这些蛋白质可以是直接与DNA结合的转录因子，也可以是与DNA相互作用的组蛋白或其修饰形式。

抗体与目标蛋白质结合后，通过与蛋白质A或蛋白质G偶联的珠子(beads)来沉淀这些复合物。

逆转交联：沉淀下来的蛋白质-DNA复合物被加热或其他方法处理以逆转交联，使蛋白质与DNA分离。

DNA纯化和分析：释放的DNA被纯化，并通过PCR、qPCR、微阵列或测序（如ChIP-seq）等方法进行分析，以确定特定蛋白质在基因组中的结合位点或组蛋白修饰的分布。

数据分析：对于ChIP-seq等高通量测序数据，需要通过生物信息学工具进行分析，以识别富集的DNA区域，并通过比较不同样本或条件下的数据来揭示蛋白质-DNA相互作用的差异。 

6、ChIP如何实现细胞交联

在ChIP实验中，细胞交联通常是通过使用甲醛或多聚甲醛来实现的。交联的目的是将蛋白质与DNA之间的相互作用固定下来，以便在后续的实验步骤中进行分析。

甲醛：能够穿透细胞并与蛋白质的氨基酸残基以及DNA的碱基发生反应，形成稳定的共价键。甲醛交联的特点是形成的共价键是可逆的，这意味着在后续实验中可以通过特定的化学处理（如加入甘氨酸）来终止交联，以便进行DNA和蛋白质的分离和分析。

多聚甲醛：多聚甲醛是甲醛的聚合形式，通常以粉末状态存在，使用前需要在热水中溶解以形成甲醛溶液。多聚甲醛在水溶液中会缓慢释放甲醛，因此也可以用于细胞的交联。

多聚甲醛的优点是它比甲醛更稳定，便于储存和处理，但释放甲醛的速度较慢，在使用时需要确保wan全水解成甲醛。

7、过度交联的影响

蛋白质结构破坏：过度交联可能会改变蛋白质的三维结构，导致蛋白质变性，从而影响其与DNA的相互作用。

抗原表位掩盖：交联剂可能会与蛋白质的抗原表位发生反应，从而掩盖这些表位，使得后续的抗体无法有效识别和结合目标蛋白质。

DNA损伤：过度交联可能导致DNA链之间过度交联，使得DNA片段在超声或酶消化过程中难以被有效切割，影响染色质片段化的质量。

分辨率降低：在ChIP实验中，理想的DNA片段大小通常在200-800 bp之间。过度交联可能会使得超声处理难以将染色质切割到理想的片段大小，从而降低实验的分辨率。

实验重复性差：由于过度交联的条件难以精确控制，每次实验的交联程度可能存在差异，这会导致实验结果的重复性变差。

样品损失：在过度交联的情况下，蛋白质和DNA的复合物可能在后续的洗涤和纯化步骤中损失，因为过度交联可能增强这些复合物之间的结合力。

图3 交联时间的影响

小鼠心脏(H)、脑(B)和肝脏(L)细胞需交联10min或30min，如图（左小图）所示。染色质制备后声处理4min，富集的DNA通过使用指ding基因引物进行实时PCR来进行定量（右小图）。每份样品中的免疫沉淀DNA量表示为标准化信号与阴性位点GAPDH的比值（等于1）。

*图片来源于网络，仅供学习参考用

8、为什么要将染色质片段化？

提高抗体接触：染色质是DNA和组蛋白紧密结合的复合物，通常存在于细胞核中。在ChIP实验中，需要使用特定抗体来识别并结合目标蛋白质。将染色质片段化可以增加抗体接触和结合目标蛋白质的机会。

便于免疫沉淀：染色质片段化后，DNA片段的长度通常在200-1000碱基对之间。这样的片段大小便于抗体识别和结合，同时也便于后续的免疫沉淀步骤。

提高分辨率：通过将染色质切割成较小的片段，ChIP实验可以提供更高的分辨率，从而更精确地定位蛋白质在基因组上的结合位点。

减少背景信号：适当的染色质片段化有助于减少非特异性的背景信号，因为较大的染色质片段可能包含多个非目标结合位点，导致非特异性的免疫沉淀。

便于DNA纯化和分析：较小的DNA片段更容易从蛋白质中分离出来，便于后续的DNA纯化和分析，如PCR、测序或微阵列分析。

提高实验效率：适当的染色质片段化可以提高ChIP实验的效率，因为较小的片段更容易被处理和分析，从而减少了实验操作的复杂性和时间。

9、超声法和酶解法的区别？

超声法：能够产生随机大小的DNA片段，适用于需要评估组蛋白和组蛋白修饰的实验，因为这些是染色质的富集和稳定组分。超声法适合于X-ChIP，即交联后的染色质。但是需要优化超声处理条件以避免过度破碎。超声处理产生热量，需要在冰冷的条件下进行，并且要避免气泡的产生（气泡会导致局部温度无法有效冷却，影响效率和准确性，同时会造成剪切力不均等）。在实验的一致性和重复性对比酶解法较差。

酶解法：使用微球菌核酸酶(MNase)等酶进行染色质的温和碎裂，相对温和更适合于评估转录因子和辅因子的结合，因为这些因子与DNA的相互作用可能不太稳定。酶解法在实验之间具有更高的可重复性，并且产生的DNA片段大小相对一致，但酶消化可能不会产生染色质的随机切片，而是有偏好性地切割某些区域，可能导致某些位点被过度表达或遗漏。此外，酶解法操作仍需要超声处理来打破核膜并在用酶消化后释放出染色质。

X-ChIP常用的染色质片段化的方式为酶解法（微球菌核酸酶MNase）和超声法，N-ChIP更依赖于酶解法。

10、如何确定染色质片段化的程度？

琼脂糖凝胶电泳是较常用的方法来检查染色质片段化的效果，che底的MNase消化会产生含150个碱基对的DNA片段（单核小体），不che底的消化也能产生含150-750个碱基对的DNA片段（单核小体、双核小体和三核小体）。超声处理产生150-1000个碱基对的许多染色质片段。要确定获得所需DNA大小并避免不必要的染色质损伤所需要的最di声处理量。

图4 酶消化的染色质在琼脂糖凝胶上进行处理

泳道1显示消化不足的染色质。泳道2显示消化适当的染色质，而泳道3则显示过度消化的染色质。

*图片来源于网络，仅供学习参考用

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