细胞活性检测 | 揭秘细胞活力的六大常用方法

在生物医学研究的广阔领域中，细胞活性检测扮演着至关重要的角色。它不仅帮助科学家们评估细胞的生存状态，还能深入了解细胞对药物、环境变化或病理过程的响应。细胞活性检测通常包括测量细胞增殖、细胞毒性和细胞死亡等方面。今天，小爱向大家介绍细胞活性检测的六大常用方法：ATP生物发光法、LDH检测法、MTT比色法、CCK-8法、荧光染料法和细胞凋亡检测法，一起揭秘细胞活力的科学奥秘。

1、ATP生物发光法

细胞内ATP（腺苷三磷酸）的含量是细胞能量代谢的直接指标。ATP生物发光法通过测量细胞内ATP的水平来评估细胞活性。这种方法具有高灵敏度和宽动态范围，尤其适合于需要高灵敏度检测的实验。

图1 ATP检测试剂盒(abs580117)检测细胞活性的原理图

ATP生物发光法的主要原理是在有氧环境下，荧光素在荧光素酶和Mg²⁺的催化作用下与ATP发生反应，生成荧光素-AMP复合体并释放出焦磷酸(PPi)。随后，荧光素-AMP复合体在O₂的作用下进一步生成氧化荧光素，同时释放出CO₂和H₂O。在这个过程中，激发态的氧化荧光素返回到基态时会发出光子，光子的数量与ATP含量成正比，因此可以通过测量光强度来定量ATP的含量。

2、LDH检测法

乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)是一种广泛存在于细胞中的酶，它在糖酵解途径中起着关键作用，能够催化乳酸和丙酮酸之间的可逆反应。LDH催化乳酸产生丙酮酸，丙酮酸与 2,4-二硝基ben肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈棕红色，颜色的深浅与丙酮酸的浓度呈正比，通过测定OD值，可计算LDH的活力。在细胞活性检测中，LDH的释放通常被用作细胞膜完整性的指标。当细胞膜受损时，细胞内的LDH会释放到培养基中，通过测定培养基中LDH的活性，可以评估细胞的损伤或死亡程度。

3、MTT比色法

MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）比色法是一种经典的细胞活性检测方法。它通过测量活细胞中脱氢酶的活性，将MTT还原成紫色的甲瓒产物，从而间接反映细胞的代谢活性。这种方法操作简单，成本低廉，是实验室中常用的筛选工具。

4、CCK-8法

CCK-8(Cell Counting Kit-8)法是一种基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑单钠盐）的比色方法。它通过测量细胞线粒体脱氢酶的活性来评估细胞活性。CCK-8法具有较高的灵敏度和较宽的动态范围，适合于各种细胞类型的活性检测。

5、荧光染料法

荧光染料法利用特定的荧光染料，如Calcein-AM或CFSE，来标记活细胞。这些染料在活细胞内被代谢成荧光产物，通过流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。荧光染料法可以提供直观的细胞活力图像，适用于细胞增殖和迁移研究。

6、细胞凋亡检测

细胞凋亡是细胞程序性死亡的过程，与细胞活性密切相关。通过Annexin V和PI（碘化丙啶）染色，可以检测细胞表面的磷脂酰丝氨酸外化，从而评估细胞凋亡的程度。这种方法对于研究细胞死亡机制和药物毒性具有重要意义。

细胞活性检测六大常用方法优缺点比较

每种方法都有其特定的应用场景和限制，选择合适的检测方法需要根据实验的具体需求和条件来决定。

下面小爱着重为大家介绍具有高灵敏度、操作简便、快速等优点的ATP检测法。

ATP检测试剂盒(abs580117)使用方法

一、产品组成

二、使用方法

1、需自备的试剂和器材

1）细胞培养用pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)

2）Triton X-100

3）系列可调节量程移液器及吸头

4）离心管及白色96孔板

5）化学发光酶标仪

2、实验前准备

1）样品准备：

①细胞培养上清的准备：将需要测定的细胞接种到培养板中，经过干预因素处理后，直接吸取细胞上清，如果是悬浮细胞，4℃、300g离心5min，收集上清。

②细胞裂解上清的准备：将需要测定的细胞(1×10⁶-1×10⁷)收集到5mL的离心管中，4℃、300g离心5min，弃去上清，然后加入200μL含0.1%Triton X-100的PBS，冰浴裂解30min，4℃、10000g离心10min，收集上清。

③组织裂解上清的准备：将需要测定的组织(20-50mg)收集到玻璃匀浆器或自动匀浆管中，然后加入500μL含1%Triton X-100的PBS，匀浆1min，4℃、10000g离心10min，收集上清。

注：各种样品，如果不立即进行测定，请冻存于-80℃；正式测定前根据预实验结果，利用ATP Assay Buffer将样品适当稀释后进行测定。

2）标准品的准备：

在1.5mL离心管中，加入990μL ATP Assay Buffer，再取10μL的100μM浓度ATP Standard加入离心管中配制1μM浓度ATP Standard；然后取另外8根1.5mL离心管，分别加入200μL ATP Assay Buffer，再吸取200μL的1μM浓度ATP Standard依次倍比稀释为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156、0.0078、0.0039μM浓度。

3）检测工作液的准备：

ATP检测工作液的配制：根据待测样品数参考下表配制适当量的ATP检测工作液，表中试剂按比例混合后即为ATP检测工作液。

3、操作步骤

1）在白色96孔板中设置空白对照孔、标准品孔和样品孔，参考下表，在空白对照孔中加入50μL ATP Assay Buffer，在标准品孔中加入50μL梯度浓度ATP 检测工作液(0.0039-1μM)，在样品孔中加入50 μL样品。

2）如上表所示，各孔加入50μL的ATP检测工作液，混匀，室温孵育5min。

3）待反应完成后，利用化学发光酶标仪测定相对发光强度(RLU)。

4）计算结果：利用标准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标制作标准曲线，并获得横纵坐标之间的函数关系式，然后利用各样品的RLU值计算样品中ATP浓度。ATP标曲测定如下图所示：

细胞活性检测是连接基础研究与临床应用的桥梁。通过上述六种常用方法，研究人员可以更准确地评估细胞的生存状态，为疾病治疗和药物开发提供重要信息。随着生物技术的不断进步，未来可能会有更多创新的检测方法问世，为我们揭示细胞活力的更多奥秘。

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