快速内切酶SpeI

AG8亚国服务的快速内切酶是一系列经过基因工程重组、能够在5~15分钟内精确完成DNA切割的限制性内切酶，适用于质粒DNA、PCR产物或基因组DNA等的快速酶切。AG8亚国服务的快速内切酶具有如下特点：5~15分钟内即可完成酶切；共用一种酶切Buffer，大大简化酶切反应体系；良好的酶活冗余度，轻松应对底物过量或困难模板酶切。此外，AG8亚国服务生物去磷酸化、连接试剂在配套的Buffer中具有100%活性，支持一管化反应，提升“酶切-修饰-连接"的体验。
识别位点：
5'...A ↓ C T A G T...3'
3'...T G A T C ↑ A...5'
同裂酶：AhlI，BcuI
注：同裂酶对于不同的甲基化修饰也许具有不同敏感性。

快速内切酶SpeI产品组分：

1. 快速内切酶SpeI  DNA 快速酶切流程：
① 在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：

a. 本体系适用于经过纯化的 PCR 产物酶切。未纯化的 PCR 产物具备一定的离子强度，10× Cut Buffer 加入量可适当减少至 2 μl。但由于 DNA 聚合酶同时具有外切酶活性，会影响酶切产物，因此如下一步需进行克隆等操作，建议酶切前对 PCR 产物进行纯化。
② 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴；
③ 37℃温育 15 min（质粒），或 15~30 min（PCR 产物），或 30~60 min（基因组 DNA）；
④ 80℃温育 20 min 即可使酶失活，停止反应（可选）。
2. 双酶切或多酶切：
① 每种快速内切酶的用量为 1 μl，并根据需要适当扩大反应体系；
② 所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的 1/10；
③ 如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同，应先以最适温度低的酶开始酶切，再添加最适温度较高的酶，在其最适反应温度下进行酶切反应。
3. 适用于质粒的扩大反应体系：
注：如果总反应体系大于 20 μl，应适当增加温育时间，尽量使用水浴、金属浴或沙浴。
不同 DNA 中的酶切位点数量：

甲基化修饰影响：

在不同反应缓冲液中的活性：

-20℃，有效期2年。

建议反应条件：
1× Cut 缓冲液；
37℃温育；
参照“DNA 快速酶切流程"配制反应体系。
失活条件：
80℃温育 20 min。
质量控制：
功能活性检测：
最适反应温度下，在 20 μl 反应体系中，1 μl SpeI 能够在 15 min 内*消化 1 μg pUC19-SpeI DNA。
超长时间温育检测：
最适反应温度下，将 1 μl SpeI 与 1 μg pUC19-SpeI DNA 共同温育 3 h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解，延时酶切可能出现星号活性。
酶切 - 连接 - 再酶切检测：
最适反应温度下，使用 1 μl SpeI 消化底物，回收酶切产物。在 22℃下使用适量 T4 DNA Ligase(Fast) 可以将酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开连接产物。
非特异性内切酶活性检测：
最适反应温度下，将 1 μl SpeI 与 1 μg 超螺旋质粒DNA 共同温育 4 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，质粒 DNA 仍然处于超螺旋状态。
蓝白斑检测：
将含有单一 lacZα 基因的载体以 1 μl SpeI 消化，重新连接后转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有对应抗生素、IPTG和 X-gal 的 LB 培养基平板上。连接正确的产物会生长出蓝色菌落，而连接错误（即 DNA 末端切口不完整）的产物将得到白色菌落。对于AG8亚国服务的系列限制酶而言，白色菌落比例应小于 1%。