一、准备工作
1、仪器设备
CO2 培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅(abs72023)或水浴摇床,医用冰箱、-80℃冰箱、移液器(一套)、眼科剪、眼科镊。
2、试剂耗材
小鼠正常肝类器官培养基(abs9539),基质胶(低因子、无酚红)(abs9495),60mm细胞培养皿(abs7005), 100μm滤筛(abs7009),15ml离心管(abs7102),1.5ml EP管若干(abs7119),24孔细胞培养板(abs7058)、金属冰盒、眼科剪刀、眼科镊。
试剂盒组成
组分名称 | 规格 |
小鼠正常肝类器官培养基 A | 100ml |
原代培养缓冲液 B | 250ml |
小鼠正常肝原代组织消化液 C | 30ml |
类器官传代消化液 D | 30ml |
组织保存液 E | 100ml |
类器官冻存液 F | 20ml |
类器官传代培养缓冲液 G | 250ml |
(1)将组织放入含有预冷的(2-8°C)组织保存液 E的取样瓶中(浸没整个组织),4℃从医院/实验室取回。
(2)将取样瓶消毒,组织取出放入培养皿样本拍照,并登记,大小,颜色,软硬程度,组织类型等信息。
在60mm细胞培养皿(abs7005)里用2-3ml原代培养缓冲液 B浸泡。用原代培养缓冲液 B清洗三次(每次更换培养皿)后剪碎,剪成大约1-3mm3的组织块,静置2次。
3、类器官操作流程之——消化-过滤
基质胶计算:第3步后观察收集到的组织体积,添加25倍组织体积的基质胶(abs9495)重悬铺板(金属冰盒或冰上操作)。
以24孔细胞培养板为例,每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板(金属冰盒或冰上操作),将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶,添加500-750μl 小鼠正常肝类器官培养基 A(恢复室温)进行培养。
6、类器官操作流程之——观察
一、类器官传代培养之-样本收集
1、移液器吸去培养基,每孔添加 1-2ml左右4℃类器官传代培养缓冲液G放置 2min。
2、移液抢轻柔吹打基质胶,收集在 15ml 离心管中,4℃静置 10min(每 6-8 孔为一组) 。
二、类器官传代培养之-样本消化
1、类器官数量不足或体积较小时:300g 4℃ 离心 5min 弃去上清,添加1ml类器官传代培养缓冲液 G重悬移入 5ml 离心管,300g4℃ 离心 5min(如图5)弃去液体进行第3步。
2、类器官数量较多或体积较大时:300g 4℃ 离心 5min 弃去上清,添加适量类器官传代消化液 D(是类器官悬液的1-2倍)超净台内消化 2-3min(中间可以吹打1-2次)(如图6) ,添加适量类器官传代培养缓冲液 G(缓冲液G:传代消化液D=5:1)终止消化,300g 4℃ 离心 5min 弃去上清,添加1ml类器官传代培养缓冲液 G重悬移入 1.5ml( 如图7) 离心管,300g 4℃ 离心 5min 弃去液体进行第3步。(如图4)
三、类器官传代培养之-铺板
类器官收集后,添加25倍基质胶重悬(基质胶体积:细胞沉淀体积=25:1),每孔25μl(如图8) 基质胶铺在 24孔细胞培养板中,放置培养箱中 10-15min 添加 500μl-750ul(如图9)小鼠正常肝类器官培养基 A。
四、类器官传代后增殖现象
1、移液器吸去培养基,每孔添加 1-2ml 左右4℃类器官传代培养缓冲液G放置 2min。
2、移液抢轻柔吹打基质胶,收集在 15ml 离心管中,4℃静置 10min(每 6-8 孔为一组) 。
3、300g 4℃ 离心 5min 弃去上清,添加1ml类器官传代培养缓冲液 G重悬移入 5ml 离心管,300g4℃ 离心 5min(如图5)弃去液体。4、添加适量类器官冻存液 F,轻柔吹打重悬,以24孔细胞培养板为例:密度为2个孔冻存 1管(500个/ml密度冻存),每管体积1.4ml。
5、冻存方法(1):将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜,第二天取出放入液氮罐。
冻存方法(2):4℃冰箱放置30 min,转移至-20℃放置1 h,最移至-80℃过夜,第二天取出放入液氮罐。
1、实验前准备
(1)将水浴锅预热至37℃;
(2)细胞实验室进行常规消毒,用预防喷雾喷涂并且使用紫外线照射40min的超净工作台台面;
(3)在超净工作台中按次序摆好消过毒的离心管、吸管、培养板等。
2、取出冻存管
根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
从液氮罐中取出冻存盒,取出所需的冻存管,同时核对冻存管外的编号。
3、迅速解冻
迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻,并要不断地摇动,使管中地液体迅速融化。约1-2min后冻存管内液体溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管地外壁,再拿入超净台内。
4、将类器官组织液移入15ml离心管,添加类器官传代培养缓冲液 G 10ml重悬,轻柔吹打混匀,300g 4℃ 离心 5min。
5、弃上清,添加1ml 类器官传代培养缓冲液 G重悬将沉淀转移至1.5ml EP管,300g 4℃ 离心 5min,弃去上清。
6、添加25倍基质胶(abs9495)重悬(基质胶体积:细胞沉淀体积=25:1),每孔25μl基质胶铺在 24孔细胞培养板中,放置培养箱中 10-15min 添加 500μl-750ul 小鼠正常肝类器官培养基 A。
一、类器官鉴定-类器官收集
1、类器官收集;
2、清洗1-3遍,洗去大部分基质胶,离心弃去大部分上清。
二、类器官鉴定-琼脂糖凹槽制备
三、类器官鉴定-固定
四、类器官鉴定-包埋
五、类器官鉴定-HE染色
六、类器官鉴定-HE染色结果(以肺癌为例)
今天讲解就到这了,大家如有类器官问题,欢迎公众号后台留言~
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