IF=63.714！丨mRNA高分文献不容错过

2021年8月19日，张锋团队在国际学术期刊Science上发表了题为：Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery 的研究论文。

研究团队开发了一种全新的RNA递送平台——SEND（Selective Endogenous eNcapsidation for cellular Delivery），SEND的核心是逆转录病毒样蛋白PEG10，它能够与自身的mRNA结合并在其周围形成球型保护囊。研究团队将其改造设计后用来包装和递送RNA，使用SEND系统将CRISPR-Cas9基因编辑系统递送给小鼠和人类细胞并成功编辑了目标基因，这将为基因治疗提供一种全新的递送载体。SEND系统是利用人类内的组分自组装为病毒样颗粒，与其他递送载体相比，所引起的免疫反应更少，更具安全性。

哺乳动物细胞形成Gag同源物的计算筛选

为了鉴定具有转移特定核酸潜力的基因，研究人员专注于包含核心衣壳(CA)结构域的Gag同源物，该结构域保护逆转录转座子和外源逆转录病毒的基因组。基因组分析确定了哺乳动物基因组中的许多内源性Gag同源物，形成分泌在细胞外囊泡内的衣壳样颗粒（EVs）。

图1 鉴定形成衣壳并被分泌的哺乳动物逆转录元件衍生的Gag同源物

MmPEG10 结合并分泌其自身的mRNA

为了确定这些蛋白质是否在EV内分泌，研究人员在人胚胎肾（HEK）293 FT细胞中过表达每个含CA基因的表位标记小鼠直向同源物，并收集全细胞裂解物和病毒样颗粒（VLP）。

图2 MmPEG10蛋白和mRNA在体外由细胞分泌到囊泡中

结果表明，MmMOAP1、MmArc、MmPEG10和MmRTL1都存在于VLP级分中，但MmPEG10是VLP级分中丰富的蛋白质。此外，内源性MmPEG10，很容易在无细胞成年小鼠血清中检测到。
 

接下来，研究人员使用RNA测序测试了由Gag同源物形成的任何衣壳样颗粒是否包含特定的mRNA。发现MmPeg10转录激活导致可观数量的全-VLP部分中的长度MmPeg10 mRNA转录本。

图3 带有MmPeg10的5和3’UTR的侧翼mRNA能够将mRNA功能性地细胞间转移到靶细胞中

PEG10是一个进行RNA传递的模块化平台

为了生成内源性的SEND系统，研究人员测试了VSVg是否可以被内源性融合跨膜蛋白替代。鉴于MmPeg10/HsPEG10和合胞素基因的重叠组织表达，还测试了用MmSYNA或MmSYNB对小鼠SEND系统进行假型与使用VSVg进行假型的可行性。结果表明，这种细胞类型适合通过这些融合素进行转导。
 

研究人员将转导增强剂vectofusin-1添加到MmSYNA和MmSYNB颗粒的上清液中，以增强体外转导。在这些原代细胞中，VSVg和MmSYNA都启用了SEND介导的Mm.cargo(Cre)功能转移，而MmSYNB则没有。

同样，这种包装是高度特异性的，因为只有UTR侧翼的mRNA[即Mm.cargo(Cre)]被功能转移。与MmSYNA一起，SEND可以配置为功能基因转移的内源系统。

图4 SEND 是一个模块化系统，能够将基因编辑工具传递到人类和小鼠细胞中

之后研究人员开始探索MmPEG10介导的MmPeg10 RNA在神经元中的内源性作用。携带天然PEG10转录本的MmSYNA假型VLP的功能转移到原代小鼠皮层神经元，导致许多参与神经发育的基因上调。

为了进一步表征该系统组件的模块化，研究人员测试了不同的货物RNA。测试了SEND 是否可以介导大约5kb Mm.cargo（SpCas9）的功能转移到N2a细胞系中，这些细胞系组成性表达针对MmKras的单一向导RNA（sgRNA）。

SEND能够在功能上转移SpCas9，导致受体细胞中约60%的插入和缺失（indels）；与Cre的结果相似，SEND是特异性的，只能有效地功能转移SpCas9，两侧是全长或优化的Peg10 UTR序列。

为了创建用于递送sgRNA和SpCas9的多合一载体，研究人员测试了SEND是否可以有效递送sgRNA。并将它们与表达Cas9的N2a细胞一起孵育；即使直接转染向导显示强大的插入缺失形成，也可以检测到非常少的活性。

图5 SEND是一个模块化系统，能够将基因编辑工具传递到人类和小鼠细胞中

作者表示SEND技术可以补充现有的病毒递送载体和脂质纳米颗粒，以扩展向细胞递送基因和编辑疗法的工具箱。

Segel M, Lash B, Song J, Ladha A, Liu CC, Jin X, Mekhedov SL, Macrae RK, Koonin EV, Zhang F. Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery. Science. 2021 Aug 20;373(6557):882-889.

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